具核梭杆菌促进小鼠结肠肿瘤发生及其机制研究*

李 菁 于亚男 姜晓娜 路艳艳 杨 林 荆 雪 田字彬&

青岛大学附属医院消化内科1(266003) 海军青岛第一疗养院2



具核梭杆菌促进小鼠结肠肿瘤发生及其机制研究*

李 菁1#于亚男1姜晓娜2路艳艳1杨 林1荆 雪1田字彬1&

青岛大学附属医院消化内科1(266003) 海军青岛第一疗养院2

背景：越来越多的证据表明结直肠癌(CRC)与肠道菌群密切相关。近年研究显示具核梭杆菌在CRC发生中可能发挥重要作用，但具体作用机制尚不明确。目的：探讨具核梭杆菌与CRC发生的相关性及其可能作用机制。方法：选用野生型C57BL/6小鼠和肠道多发性腺瘤APC(Min/+)小鼠，分别予具核梭杆菌菌液灌胃、皮下注射致癌剂1,2-二甲基肼二盐酸盐(DMH)或两者联合等不同处理，观察结肠异常隐窝灶(ACF)(8周)或肿瘤(20周)生成情况。以Roche 454 GS FLX焦磷酸测序分析各组野生型C57BL/6小鼠肠道菌群结构，Bio-Plex ProTM技术检测肠黏膜免疫因子表达。结果：与无具核梭杆菌定植的DMH处理组野生型C57BL/6小鼠或APC(Min/+)小鼠相比，具核梭杆菌定植小鼠结肠内ACF或肿瘤数量显著增多(P<0.05)。具核梭杆菌定植小鼠肠道菌群结构改变明显，表现为蓝藻菌门含量减少，软皮菌门、疣微菌门含量增加(P均<0.05)，肠黏膜肿瘤相关免疫因子IL-21、IL-22、IL-31、CD40L表达亦显著增高(P<0.05)。结论：具核梭杆菌在肠道定植可促进小鼠结肠肿瘤发生，其机制可能主要为引起肠道菌群失衡和调控肠黏膜肿瘤相关免疫因子表达。

结直肠肿瘤； 肠道菌群； 具核梭杆菌； 免疫，黏膜

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病率和死亡率在全球恶性肿瘤统计中均居前列，近年我国发病率亦呈上升趋势[1]。CRC发病受遗传、饮食结构、生活方式、肠道稳态、免疫功能以及肿瘤相关信号通路激活等多种因素影响，且越来越多的证据表明CRC与肠道菌群密切相关[2-5]，某些肠道共生菌可通过影响结直肠乃至整个消化系统的生理功能影响CRC发生[6-7]。

具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)是一种厌氧菌，分析显示CRC患者肿瘤组织中的具核梭杆菌含量较正常组织显著增加[8-9]。研究[9-10]发现，具核梭杆菌在CRC的“腺瘤-腺癌”发生途径中表现出逐步富集的趋势，提示其在CRC发生中可能发挥重要作用，但具体作用机制尚不明确。本研究应用动物模型探讨具核梭杆菌与CRC发生的相关性，并尝试探索其致CRC发生的可能作用机制，以期为更全面地了解具核梭杆菌在CRC发生、发展中的作用提供有力证据，同时为CRC的防治提供依据。

材料与方法

一、实验动物、菌株、主要试剂和仪器

野生型C57BL/6小鼠60只(上海斯莱克实验动物有限公司)，雄性，4～5周龄，体质量(18±2) g；APC(Min/+)小鼠30只(南京大学模式动物研究所)，雄性，4～5周龄，体质量(18±2) g。所有小鼠均饲养于青岛大学附属医院SPF级动物实验中心，适应性饲养1周后开始实验。

具核梭杆菌ATCC 25586菌株[9]和非致病性大肠杆菌ATCC 47076菌株[11](美国模式培养物集存库，ATCC)。1,2-二甲基肼二盐酸盐(dimethyl-hydrazine, DMH)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，粪便基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Stool DNA Kit, Omega Bio-tek Inc.)，Bio-Plex ProTM人细胞因子、趋化因 子和生长因子磁性微球检测试剂(Bio-Rad Laboratories, Inc.，可定量检测来自多种基质如血清、血浆、组织培养物上清液中53种分析物的水平)。

Roche 454测序系统(GS FLX Titanium System, Roche公司)。

二、实验方法

1. 细菌培养：将具核梭杆菌ATCC 25586菌株培养于含氯化血红素、K2HPO4、维生素K1、L-半胱氨酸盐酸盐的脑心浸液基础培养基中，置于37 ℃厌氧工作站培养24 h[12]。非致病性大肠杆菌ATCC 47076菌株培养于LB培养基中[11]。两种细菌培养后分别经离心机分离，PBS悬浮备用。

2. 动物分组和处理：60只野生型C57BL/6小鼠随机分为6组，每组10只。①对照组：PBS溶液灌胃，皮下注射 0.9% NaCl溶液；②DMH组：PBS溶液灌胃，皮下注射DMH制作结肠肿瘤模型(DMH可通过诱导DNA甲基化发挥强致癌作用)[13]；③具核梭杆菌组(Fn组)：具核梭杆菌菌液灌胃，皮下注射0.9% NaCl溶液；④Fn+DMH组：具核梭杆菌菌液灌胃，皮下注射DMH；⑤大肠杆菌组(Ec组)：大肠杆菌菌液灌胃，皮下注射0.9% NaCl溶液；⑥Ec+DMH组：大肠杆菌菌液灌胃，皮下注射DMH。

30只APC(Min/+)小鼠随机分为3组，每组10只。①对照组：PBS溶液灌胃；②Fn组：具核梭杆菌菌液灌胃；③Ec组：大肠杆菌菌液灌胃。

PBS、具核梭杆菌菌液或大肠杆菌菌液灌胃剂量为每天0.1 mL(菌液中细菌计数为109CFU)，0.9% NaCl溶液、DMH皮下注射剂量为20 mg/kg，每周一次。上述处理持续8周以确保异常隐窝灶(aberrant crypt foci, ACF)形成，或持续20周以确保结肠肿瘤形成。观察终点包括结肠ACF或肿瘤生成情况(亚甲蓝染色和HE染色)、肠道菌群结构变化和肠黏膜免疫因子表达。

3. 焦磷酸测序法超高通量基因组测序：每只小鼠取200 mg粪便，按试剂盒说明书操作提取细菌总DNA。以指定区域V1-V3可变区设计、合成通用融合引物，行PCR扩增，按仪器说明书操作对扩增所得DNA行Roche 454 GS FLX高通量测序[14-15]。细菌16S rRNA引物序列：27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, 533R 5’-TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’。

应用Mothur 1.14软件对测序结果进行分析，质量控制和特殊分类程序参照既往研究[2]。不同样本间差异的分析采用Metastats分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)。某一菌群的相对丰度以该菌群序列数占细菌总序列数的百分比表示。

4. 肠黏膜免疫因子检测：以含PMSF(1∶100)、蛋白酶抑制剂混合物(1∶100)、磷酸酶抑制剂混合物(1∶100)的RIPA裂解液裂解小鼠结肠黏膜组织，使用 Bio-Plex ProTM磁性微球检测试剂进行免疫因子检测[16]。

三、统计学分析

结 果

一、具核梭杆菌促进小鼠结肠肿瘤发生

1. 野生型C57BL/6小鼠：实验终点8周时，对照组、Fn组和Ec组结肠未见明显ACF生成，DMH组结肠黏膜中可见较多ACF，Fn+DMH组ACF数量较DMH组和Ec+DMH组显著增多(P<0.05)(图1A)。

实验终点20周时，对照组、Fn组和Ec组未见明显结肠肿瘤生成，DMH组可见结肠肿瘤，Fn+DMH组结肠肿瘤数量较DMH组和Ec+DMH组显著增多(P<0.05)(图1B)。

2. APC(Min/+)小鼠：实验终点8周时，Fn组结肠肿瘤数量较对照组和Ec组显著增多(P<0.05)(图1C)。

上述发现表明具核梭杆菌在肠道定植可促进结肠肿瘤发生。

二、具核梭杆菌改变小鼠肠道菌群结构

Roche 454 GS FLX焦磷酸测序和PCA分析显示，6组野生型C57BL/6小鼠粪便菌群结构存在显著差异，主成分PC1和PC2分别为19.67%和15.8%。Fn组和Fn+DMH组主成分均偏离PC2方向轴，而对照组、DMH组、Ec组、Ec+DMH组主成分均靠近PC2方向轴，有具核梭杆菌定植的小鼠粪便菌群主成分与无该菌定植者存在显著差异(P<0.05)(图2)，表明具核梭杆菌在肠道定植可改变肠道菌群结构。

图1 具核梭杆菌促进小鼠结肠肿瘤发生

进一步行细菌门水平的分析，结果证实仅Fn组和Fn+DMH组有梭杆菌门(Fusobacteria)定植；分析发现，各组间放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)含量无明显差异(P>0.05)，Ec组变形菌门(Proteobacteria)含量较对照组显著增加(P<0.05)，Fn+DMH组蓝藻菌门(Cyanobacteria)含量较对照组显著减少(P<0.05)，Fn组、Fn+DMH组软皮菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verruco-microbia)含量分别较对照组、DMH组显著增加(P<0.05)(图3)。

图2 各组野生型C57BL/6小鼠粪便菌群PCA分析图

三、具核梭杆菌促进小鼠肠黏膜免疫因子分泌

各组野生型C57BL/6小鼠结肠黏膜Bio-PlexProTM检测显示，在白细胞介素-17F(IL-17F)、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、IL-33、CD40配体(CD40L)、巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)八种免疫因子中，Fn组、Fn+DMH组IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、CD40L表达水平分别较对照组、DMH组显著增高(P<0.05)，各组间IL-33、MIP3α表达水平无明显差异(P>0.05)(图4)，表明具核梭杆菌在肠道定植可促进肠黏膜免疫因子分泌。

讨 论

在过去的30余年中，大量证据表明微生物感染尤其是病毒感染与人类癌症发生之间存在密切联系。Parkin[17]对2002年全球癌症数据的分析显示，感染相关癌症例数为190万，占全球癌症负荷的17.8%，主要病原体包括幽门螺杆菌、人乳头状瘤病毒、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒、HIV、人疱疹病毒以及血吸虫、肝吸虫等。尽管目前对CRC的病因尚不明确，但炎症被公认为是CRC的危险因素之一。2012年，Castellarin等[8]的研究发现，与配对正常组织相比，CRC组织中具核梭杆菌富集，并与肿瘤淋巴结转移相关。本研究通过野生型C57BL/6小鼠和肠道多发性腺瘤APC(Min/+)小鼠两部分动物实验， 验证了具核梭杆菌在小鼠肠道定植后可促进结肠肿瘤发生。

人体肠道菌群对维持肠道内环境稳定以及肠道屏障、免疫和代谢功能至关重要，其与黏膜免疫系统共同决定肠道稳态，并在某种程度上代表肠道内环境[18-19]。免疫功能紊乱在肠道共生菌诱导炎症和肿瘤发生的过程中发挥重要介导作用，肠道菌群结构因某些因素发生改变即肠道微生态失衡时，其与免疫系统之间的正常联系被打破，引起免疫功能紊乱，最终导致CRC发生、进展[19-21]。具核梭杆菌致CRC发生的机制尚未明确，目前有以下几种假说：①通过增加条件致病菌、减少有益菌干扰肠道菌群平衡；②激活肿瘤相关信号通路；③诱导肿瘤相关免疫因子如IL-21、IL-22、IL-31、CD40L等表达。研究显示，IL-21可通过调节肿瘤细胞增殖与肿瘤免疫监视参与结肠炎相关肿瘤发生[22]；CD40L则与机体对结肠癌的抗肿瘤免疫有关[23]；IL-22可能通过激活STAT3信号通路促进CRC进展[24]；IL-31对CRC细胞的增殖和移行具有调节作用[25]。

*与对照组比较，P<0.05；△与DMH组比较，P<0.05

与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01；与DMH组比较，▲P<0.05, ▲▲P<0.01

为进一步探讨具核梭杆菌促进结肠肿瘤发生的机制，本研究对各组野生型C57BL/6小鼠的粪便细菌DNA行焦磷酸测序并作PCA分析，以明确其肠道菌群结构。与人类相似，野生型C57BL/6小鼠的肠道菌群共分为952个运算分类单位(operational taxonomic units, OUTs)，主要为拟杆菌门 、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门、蓝藻菌门、软皮菌门以及未分类细菌。分析显示，正常野生型C57BL/6小鼠肠道内无梭杆菌门定植，予具核梭杆菌菌液灌胃处理后，该菌可在小鼠肠道定植，定植后的肠道菌群结构与无该菌定植的小鼠存在显著差异，表现为蓝藻菌门含量减少，软皮菌门、疣微菌门含量增加。上述发现表明具核梭杆菌定植可导致小鼠肠道菌群紊乱，进而改变肠道微生态环境，可能促进结肠肿瘤发生。

据报道，具核梭杆菌可通过调节肿瘤免疫微环境促进结直肠肿瘤进展[26]。本研究采用Bio-Plex ProTM技术检测了各组野生型C57BL/6小鼠的肠黏膜免疫因子表达，发现有具核梭杆菌定植的Fn组、Fn+DMH组小鼠肠黏膜免疫因子表达异常，表现为IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、IL-31、CD40L表达增高，提示具核梭杆菌在小鼠肠道定植可促进上述免疫因子分泌，调节肠道黏膜免疫系统，从而可能进一步激活下游信号通路，参与结肠肿瘤发生。

综上所述，具核梭杆菌在肠道定植可促进小鼠结肠肿瘤发生，提示其可能在结直肠腺瘤-腺癌的演进过程中发挥重要作用，作用机制可能主要为引起肠道菌群失衡和调控肠黏膜肿瘤相关免疫因子表达。后续拟进一步开展基于分子水平的研究，以揭示具核梭杆菌对特定细胞内信号通路的调节机制。

1 Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65 (2): 87-108.

2 Chen HM, Yu YN, Wang JL, et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma[J]. Am J Clin Nutr, 2013, 97 (5): 1044-1052.

3 Wang T, Cai G, Qiu Y, et al. Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers[J]. ISME J, 2012, 6 (2): 320-329.

4 Zhu Q, Gao R, Wu W, et al. The role of gut microbiota in the pathogenesis of colorectal cancer[J]. Tumour Biol, 2013, 34 (3): 1285-1300.

5 Wu N, Yang X, Zhang R, et al. Dysbiosis signature of fecal microbiota in colorectal cancer patients[J]. Microb Ecol, 2013, 66 (2): 462-470.

6 Neish AS. Microbes in gastrointestinal health and disease[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (1): 65-80.

7 Sonnenberg GF, Artis D. Innate lymphoid cell interactions with microbiota: implications for intestinal health and disease[J]. Immunity, 2012, 37 (4): 601-610.

8 Castellarin M, Warren RL, Freeman JD, et al.Fusobacteriumnucleatuminfection is prevalent in human colorectal carcinoma[J]. Genome Res, 2012, 22 (2): 299-306.

9 Flanagan L, Schmid J, Ebert M, et al.Fusobacteriumnucleatumassociates with stages of colorectal neoplasia development, colorectal cancer and disease outcome[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33 (8): 1381-1390.

10 Yu YN, Yu TC, Zhao HJ, et al. Berberine may rescueFusobacteriumnucleatum-induced colorectal tumorigenesis by modulating the tumor microenvironment[J]. Onco-target, 2015, 6 (31): 32013-32026.

11 Bonnet M, Buc E, Sauvanet P, et al. Colonization of the human gut byE.coliand colorectal cancer risk[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (4): 859-867.

12 Rhee KJ, Wu S, Wu X, et al. Induction of persistent colitis by a human commensal, enterotoxigenicBacteroidesfragilis, in wild-type C57BL/6 mice[J]. Infect Immun, 2009, 77 (4): 1708-1718.

13 Wang JL, Lin YW, Chen HM, et al. Calcium prevents tumorigenesis in a mouse model of colorectal cancer[J]. PLoS One, 2011, 6 (8): e22566.

14 Willing B, Halfvarson J, Dicksved J, et al. Twin studies reveal specific imbalances in the mucosa-associated microbiota of patients with ileal Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2009, 15 (5): 653-660.

15 Chen W, Liu F, Ling Z, et al. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer[J]. PLoS One, 2012, 7 (6): e39743.

16 de Jager W, te Velthuis H, Prakken BJ, et al. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2003, 10 (1): 133-139.

17 Parkin DM. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002[J]. Int J Cancer, 2006, 118 (12): 3030-3044.

18 Bäckhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, et al. Host-bacterial mutualism in the human intestine[J]. Science, 2005, 307 (5717): 1915-1920.

19 Round JL, Mazmanian SK. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2009, 9 (5): 313-323.

20 Sobhani I, Tap J, Roudot-Thoraval F, et al. Microbial dysbiosis in colorectal cancer (CRC) patients[J]. PLoS One, 2011, 6 (1): e16393.

21 Vipperla K, O’Keefe SJ. The microbiota and its metabolites in colonic mucosal health and cancer risk[J]. Nutr Clin Pract, 2012, 27 (5): 624-635.

22 Jauch D, Martin M, Schiechl G, et al. Interleukin 21 controls tumour growth and tumour immunosurveillance in colitis-associated tumorigenesis in mice[J]. Gut, 2011, 60 (12): 1678-1686.

23 Büning C, Krüger K, Sieber T, et al. Increased expression of CD40 ligand on activated T cells of patients with colon cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8 (4): 1147-1151.

24 Ernst M, Thiem S, Nguyen PM, et al. Epithelial gp130/Stat3 functions: an intestinal signaling node in health and disease[J]. Semin Immunol, 2014, 26 (1): 29-37.

25 Dambacher J, Beigel F, Seiderer J, et al. Interleukin 31 mediates MAP kinase and STAT1/3 activation in intestinal epithelial cells and its expression is upregulated in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2007, 56 (9): 1257-1265.

26 Kostic AD, Chun E, Robertson L, et al.Fusobacteriumnucleatumpotentiates intestinal tumorigenesis and modulates the tumor-immune microenvironment[J]. Cell Host Microbe, 2013, 14 (2): 207-215.

(2017-01-19收稿；2017-03-24修回)

FusobacteriumnucleatumPrompts Colonic Tumorigenesis in Mice and its Potential Mechanism

LI Jing1, YU Yanan1, JIANG Xiaona2, LU Yanyan1, YANG Lin1, JING Xue1, TIAN Zibin1.

1Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao, Shandong Province (266003);2Qingdao First Sanatorium of Navy, Qingdao, Shandong Province

tianzb@qdumh.qd.sd.cn

Colorectal Neoplasms; Gut Microbiota;Fusobacteriumnucleatum; Immunity, Mucosal

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.07.003

国家自然科学基金青年科学基金项目(81502025)，山东省自然科学基金培养基金项目(ZR2015PH011)，国家自然科学基金面上项目(81572320)

#Email: 15064800733@163.com

&本文通信作者，Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn

Background: Accumulating evidence links colorectal cancer (CRC) with the gut microbiota.Fusobacteriumnucleatum(F.nucleatum) has been revealed to be involved in the development of CRC, however, the mechanism ofF.nucleatumin mediating colorectal tumorigenesis is still poorly understood. Aims: To investigate the effect and potential mechanism ofF.nucleatumon CRC. Methods: Wild type C57BL/6 mice and APC(Min/+) mice characterized by multiple intestinal neoplasia were used in this animal study. After administered withF.nucleatumintragastrically and/or 1,2-dimethylhydrazine (DMH, a carcinogen) subcutaneously, the aberrant crypt foci (ACF) and colonic tumor were counted at 8th and 20th week, respectively. Structural alteration of intestinal microbiota and mucosal immune factors were detected in wild type C57BL/6 mice receiving different interventions by using Roche 454 GS FLX pyrosequencing and Bio-Plex ProTMcytokine assay, respectively. Results: In DMH-treated wild type C57BL/6 mice or APC(Min/+) mice, number of ACF and colonic tumor in those administered withF.nucleatumwere significantly higher than those without (P<0.05).F.nucleatumcolonization significantly altered the lumen microbial structure, with decreasedCyanobacteriumand increasedTenericutesandVerrucomicrobia(Pall <0.05). Furthermore,F.nucleatumup-regulated expressions of tumor-related immune factors in colonic mucosa, such as IL-21, IL-22, IL-31 and CD40L (P<0.05). Conclusions:F.nucleatumcolonization in intestine may prompt colonic tumorigenesis in mice via inducing intestinal dysbiosis and modulating tumor-related immune factors expression.