克罗恩病CNTNAP3基因拷贝数变异及其意义*

黄美兰 乔宇琪 沈 骏 蔡晨雯 徐锡涛 陈胜良 冉志华&

上海交通大学医学院附属仁济医院南院消化内科1(201112) 上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所 上海市炎症性肠病研究中心2



·论 著·

克罗恩病CNTNAP3基因拷贝数变异及其意义*

黄美兰1#乔宇琪2沈 骏2蔡晨雯2徐锡涛2陈胜良1冉志华2&

上海交通大学医学院附属仁济医院南院消化内科1(201112) 上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所 上海市炎症性肠病研究中心2

背景：DNA拷贝数变异是人类疾病的重要致病因素，可能参与了炎症性肠病(IBD)的发病机制和病理过程。目的：探讨CNTNAP3基因在克罗恩病(CD)中的拷贝数变异情况及其意义。方法：纳入2009年7月—2010年12月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的活动期CD患者101例，同期80例健康体检者作为正常对照。采集CD患者外周血或肠黏膜标本，以比较基因组杂交芯片(aCGH,n=8)和荧光定量PCR(n=93)筛选、验证CNTNAP3基因拷贝数变异，ELISA法(n=55)检测CNTNAP3编码蛋白表达。结果：aCGH检测显示初发CD患者染色体9p13区域(含CNTNAP3基因)存在大片段拷贝数扩增；荧光定量PCR验证并确认CD组外周血CNTNAP3基因拷贝数显著高于正常对照组，非激素治疗组差异更为明显(208 616.4±126 984.7和233 453.3±113 520.8对161 750.2±53 940.3,P<0.05和P<0.01)。在各项CD临床参数中，仅吸烟史与CNTNAP3基因拷贝数扩增显著相关(P<0.05)，但拷贝数明显扩增者的血浆CNTNAP3水平与正常对照组无明显差异(P>0.05)，与简化CD内镜评分无相关性(P>0.05)。结论：CNTNAP3基因拷贝数扩增可能参与了中国CD人群的发病，激素治疗和吸烟可能是影响该基因拷贝数变异的因素；血浆CNTNAP3水平不能用于区分CD患者与健康人。本研究结论有待进一步验证。

炎症性肠病； Crohn病； DNA拷贝数变异； CNTNAP3基因； 比较基因组学

Background: DNA copy number variation is an important pathogenic factor of human diseases and might be involved in the pathogenesis and pathological process of inflammatory bowel disease (IBD). Aims: To investigate the copy number variation of CNTNAP3 gene and its significance in Crohn’s disease (CD). Methods: A total of 101 active CD patients admitted from Jul. 2009 to Dec. 2010 at Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University were enrolled. Eighty healthy subjects were served as controls. Peripheral blood or intestinal mucosa samples of CD patients were collected, and the copy number variation of CNTNAP3 gene was screened and validated by array-based comparative genomic hybridization (aCGH,n=8) and real-time PCR (n=93); expression of CNTNAP3 encoding protein was determined by ELISA (n=55). Results: A large fragment copy number amplification was revealed by aCGH at chromosome 9p13 region (including CNTNAP3 gene) in untreated CD patients. Real-time PCR confirmed that the copy number of CNTNAP3 gene was amplified in peripheral blood of CD patients, especially steroid-naive patients as compared with the normal controls (208 616.4±126 984.7 and 233 453.3±113 520.8vs. 161 750.2 ±53 940.3,P<0.05 andP<0.01). In the clinical parameters analyzed in this study, only smoking was significantly correlated with CNTNAP3 copy number amplification (P<0.05). However, there was no significant difference in plasma CNTNAP3 level between CD patients with amplified copy number and normal controls (P>0.05). Furthermore, the plasma CNTNAP3 level in CD patients with amplified copy number was not correlated with the simplified endoscopic score for CD (P>0.05). Conclusions: Copy number amplification of CNTNAP3 gene might be involved in the pathogenesis of CD in Chinese population. Glucocorticoid treatment and smoking might affect the copy number variation of CNTNAP3 gene. Plasma CNTNAP3 level cannot discriminate CD patients from healthy subjects. Conclusions of this study needs to be further demonstrated and discussed.

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类慢性复发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcer-ative colitis, UC)，其病因和发病机制与遗传、环境、微生物、免疫因素间复杂的相互作用有关[1]，但确切病因仍未完全阐明。IBD各年龄段均可发病，但以年轻成人居多。西方国家如欧洲、北美、澳洲等地区IBD发病率较高，为10～70/10万[2]。CD是一种可累及全消化道各层次的节段性非特异性炎症性疾病[3]，既往因在我国较罕见而未得到充分重视。近年来，随着生活方式、环境因素的改变以及诊断水平的提高，我国CD患病率逐年上升[2]，已成为主要肠道疾病之一。

研究发现DNA拷贝数变异(copy number vari-ations, CNVs)是人类疾病的重要致病因素，其相关病因学研究近年广泛开展[4-5]。CD作为一种遗传因素参与发病的疾病，CNVs在其发病机制中作用的研究尚处于探索阶段。目前已发现的与CD发病有关 的CNVs有染色体8p23编码β-防御素2的DEFB2基因拷贝数下调和编码α-防御素1-3的DEFA1A3基因拷贝数上调、染色体6p21中枢主要组织相容性复合体区域补体C4基因变异体C4S拷贝数上调和C4L拷贝数下调等[6-8]。本研究通过分析中国CD人群的CNVs及其变异情况，以期筛选新的与CD发病相关的CNVs区域以及相关基因。

材料与方法

一、研究对象

纳入2009年9月—2010年3月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的CD患者8例，以比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)技术筛选CNVs。另纳入2009年7月—2010年12月收治的CD患者93例用于筛选结果的验证。入组患者临床、实验室、内镜、影像学和病理学表现符合我国IBD共识中的CD诊断标准，简化CD活动指数(CDAI)≥5分，均为活动期[9]。收集同期仁济医院健康体检中心健康人80例作为正常对照，入选者体检显示无特殊疾病(自身免疫性疾病、内分泌系统疾病、心肺肝肾功能异常、近期消化道炎症性疾病、IBD家族史、阑尾切除术史、肿瘤史等)。研究方案经医院伦理委员会审核批准，受检者留取标本前均签署知情同意书。

二、方法

1. 临床资料采集：录入所有受检者的人口学资料，包括性别、年龄、体质指数(BMI)、城郊居住情况、学历、吸烟史等；录入CD患者相关临床资料，包括实验室、内镜、影像学、病理学检查报告、蒙特利尔分型(确诊年龄：≤16岁、17～40岁、>40岁；病变部位：末端回肠、结肠、回结肠、累及上消化道；疾病行为：非狭窄非穿透、狭窄、穿透、肛周病变)[9]、治疗方式(激素、免疫抑制剂、生物制剂、无上述治疗)等。

2. 标本采集：行aCGH检测的CD患者中6例留取病变处肠黏膜标本4块，0.9% NaCl溶液清洗后速转至液氮中保存；另2例留取外周静脉血 6 mL于EDTA真空抗凝管中，速转至深低温冰箱保存。8例标本于短期内送上海康成生物工程有限公司行aCGH检测。所有留取外周静脉血标本的受试者均为空腹12 h后次日清晨肘正中静脉采血，储存于EDTA真空抗凝管。

3. 样品DNA抽提：采集的标本于2 h内使用QIAamp DNA Mini Kit或QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)行DNA抽提，操作步骤参照试剂盒说明书。所得DNA以200 μL AE缓冲液或pH 7.0蒸馏水溶解，置于1.5 mL EP管中，-20 ℃保存。

4. aCGH检测：使用NimbleGen 2.1M比较基因组杂交芯片(Roche 公司)，主要步骤：样品DNA抽提；DNA样品提纯和质控；超声裂解DNA；样品标记；准备杂交样品；Nimble芯片混合器混合样品；上样和样品杂交；洗涤杂交芯片；双色芯片扫描；数据提取分析。以标准化正常男性外周血基因组DNA(6人混合，Promega Corporation)作为正常对照。

5. 相对标准曲线法荧光定量PCR检测外周血CNTNAP3 DNA拷贝数：此步骤纳入CD患者93例和正常对照者80例。

采用Primer Express 3.0软件设计TaqMan探针。CNTNAP3: F 5’-TGC CGT AGC TCA GTG CTG TT-3’, R 5’-AAG GGC ACA CCA AGT GTA GGA-3’, FAM-TTC TTC ACA CAC AGG GCA CGC ACA-TAMRA，扩增片段大小141 bp；β-actin(内参): F 5’-GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA G-3’, R 5’-GCT CAT TGC CAA TGG TGA TG-3’, FAM-TAC GTC GCC CTG GAC TTC GAG CA-TAMRA。

标准品标准曲线制备：选取高质量人外周血样品 为模板，以不加模板者作为阴性对照，进行目的基 因片段荧光定量PCR扩增。PCR循环条件(Applied Biosystems 9700 PCR仪)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。扩增片段行琼脂糖凝胶电泳。对PCR样品进行割胶纯化，连接，转化后质粒提取，制备标准曲线。

使用目的基因探针和内参β-actin探针同时进行样品荧光定量PCR扩增，每板实验中均制备一条标准曲线。PCR循环条件(Applied Biosystems 9700 PCR仪)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

6. ELISA法检测血浆CNTNAP3水平：此步骤纳入外周血CNTNAP3基因拷贝数明显扩增的CD患者55例(将93例患者按拷贝数检测值从高到低排序，取前55例)和正常对照者62例。外周血样品3 000 r/min 离心10 min，分离血浆，-80 ℃保存。使用CNTNAP3血浆蛋白ELISA试剂盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories)，按说明书进行操作，于酶标仪450 nm波长处读取吸光度(A)值，根据标准品0、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL的A值绘制标准曲线，计算CNTNAP3水平。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

行aCGH检测的8例CD患者中6例为初发，未使用过激素、免疫抑制剂、生物制剂；2例已确诊数年，曾接受激素治疗，但未使用过免疫抑制剂和生物 制剂。8例患者男女比例为1∶7，平均年龄(30.62±15.19)岁；病变部位：末端回肠2例，结肠3例，回结肠3例；疾病行为：有狭窄无穿透3例，肛周病变2例；best CDAI 223～369，平均 292.42±69.89。8例患者均无吸烟史。

行外周血CNTNAP3基因拷贝数检测的93例CD患者中，男性57例，女性36例，男女比例为1.6∶1，年龄14～58岁，平均(30.96±10.81)岁；发病年龄13～56岁，平均(28.68±10.69)岁，平均病程27个月；BMI (20.11±2.42) kg/m2，血红蛋白(118±26) g/L，18例(19.4%)有吸烟史。病变部位：末端回肠33例(35.5%)，结肠22例(23.7%)，回结肠37例(39.8%)，累及上消化道6例(6.5%，其中5例为回结肠型)；疾病行为：非狭窄非穿透45例(48.4%)，狭窄38例(40.9%)，穿透10例(10.8%)，肛周病变10例(10.8%)。治疗情况：激素62例(66.7%)，免疫抑制剂(硫唑嘌呤、甲氨蝶呤等)45例(48.4%)，生物制剂(英夫利昔单抗)6例(6.5%)，无上述治疗31例(33.3%)。

行外周血CNTNAP3基因拷贝数检测的80例正常对照者中，男性55例，女性25例，男女比例为2.2∶1，年龄18～59岁，平均(34.57±12.19)岁，BMI (22.89±1.90) kg/m2，血红蛋白(145±13) g/L，23例(28.8%)有吸烟史。

二、aCGH检测结果

以log2 ratio≥0.2为筛选标准分析aCGH检测结果，CD患者差异DNA片段大小为6 kb～31.6 Mb，log2 ratio范围为-1.1～0.84。送检标本DNA拷贝数增加或减少片段的个数和变异程度有一定差异。最大的CNV片段位于染色体9p13区域(log2 ratio≥0.4)，为拷贝数扩增，片段大小约31.6 Mb，存在于7例标本中(图1)，仅1例曾接受激素、5-氨基水杨酸、中药治疗的女性患者未检出此CNV。该片段包含61个基因，经分析筛选出其中相关研究甚少的CNTNAP3基因作进一步验证和分析。

A～F为6例肠黏膜标本，G、H为2例外周血标本，标本F无9p13区域CNV

图1 CD患者染色体9p13区域CNV情况

三、外周血CNTNAP3基因拷贝数

Real-time PCR检测显示，CD组外周血CNTNAP3基因拷贝数为208 616.4±126 984.7，显著高于正常对照组的 161 750.2±53 940.3(P<0.05)。按是否接受激素、免疫抑制剂或生物制剂治疗进行分层分析(各亚组外周血CNTNAP3基因拷贝数见表1)，结果显示非激素治疗组与正常对照组间差异更为显著(P<0.01)，激素治疗组与正常对照组间差异无统计学意义(P>0.05)(图2)；免疫抑制剂治疗组和非免疫抑制剂治疗组与正常对照组相比、生物制剂治疗组和非生物制剂治疗组与正常对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组外周血CNTNAP3基因拷贝数比较

四、 CNTNAP3基因拷贝数与CD临床参数的关系

单因素分析显示，CD患者外周血CNTNAP3基因拷贝数仅与吸烟史有关(P<0.05)，与性别、确诊年龄、病程、病变部位、疾病行为、贫血情况以及激素、免疫抑制剂、生物制剂治疗均无相关性(P>0.05)(表1)。由于仅吸烟史P<0.1，故未进一步行Logistic回归分析。尽管本次分析未发现不同病变部位CD间的CNTNAP3基因拷贝数存在显著差异，但可观察到病变累及范围越广、CNTNAP3基因拷贝数越多的趋势。

表1 CNTNAP3基因拷贝数与CD临床参数的关系

五、血浆CNTNAP3水平与CD临床参数的关系

55例CNTNAP3基因拷贝数明显扩增的CD患者血浆CNTNAP3水平在1.714～2.169 ng/mL之间，平均(1.914±0.113) ng/mL；62例正常对照者血浆CNTNAP3水平在1.668～2.208 ng/mL之间，平均(1.948±0.129) ng/mL，两组间差异无统计学意义(P=0.08)(图3A)。进一步的分层分析显示，在CNTNAP3基因拷贝数扩增的CD患者中，血浆CNTNAP3水平与患者年龄、BMI和简化CD内镜评分(SES-CD)均无相关性(图3B-D)。

图3 CNTNAP3基因拷贝数扩增CD患者血浆CNTNAP3水平及其与年龄、BMI和SES-CD的关系

讨 论

DNA CNVs是人类疾病的重要致病因素，可能参与了IBD的发病机制和病理过程。本研究应用NimbleGen 2.1M比较基因组杂交芯片对8例活动期CD患者的肠黏膜或外周血标本行aCGH检测，发现其中7例染色体9p13区域有一段31.6 Mb大小的CNV片段，而1例此区域无大片段CNV的患者既往曾接受包括激素在内的多种药物治疗，据此推测这一大片段CNV在初发CD患者中可能是一个普遍现象。所发现的CNV片段中包含61个已知基因和一些基因间非编码区域，61个已知基因中仅CNTNAP3和PGM5基因功能明确，前者编码蛋白属于细胞识别分子NCP家族，可介导神经元与胶质细胞间的相互作用，后者则编码葡萄糖磷酸变位酶，在碳水化合物代谢过程中起关键作用[10]。由于PGM5编码蛋白的功能主要是在物质和能量代谢方面，因此本研究将目标聚焦于目前对其功能研究不多的CNTNAP3基因，探讨其CNV情况及其意义。

研究进一步收集93例临床确诊CD患者的外周血标本行CNTNAP3基因拷贝数检测，并与同期80例健康人进行比较，结果证实aCGH检测结果可靠，CNTNAP3基因在CD患者外周血标本中确实存在拷贝数扩增。分层分析显示该基因拷贝数扩增在非激素治疗组中更为显著，在激素治疗组中则与正常对照组无明显差异，在免疫抑制剂与非免疫抑制剂、生物制剂与非生物制剂治疗者中则未观察到类似现象。加之aCGH检测惟一一例无9p13区域大片段CNV的患者亦有激素使用史，提示糖皮质激素可能通过一些目前未知的机制影响CNTNAP3基因拷贝数，但本研究未发现硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、英夫利昔单抗对CNTNAP3基因拷贝数有影响，表明不同临床用药治疗CD的机制可能存在差异。有研究[11]发现，在ETV6/RUNX1融合基因阳性急性淋巴细胞白血病患者中，较之初诊患者，一些糖皮质激素信号途径相关基因如BMF、NR3C1以及错配修复途径相关基因在复发病例中存在明显的拷贝数下调变异。至于激素通过何种机制或信号途径引起CD患者CNTNAP3基因拷贝数下调，该基因是否为激素信号途径中的靶基因，尚需进一步探讨。

本研究对外周血CNTNAP3基因拷贝数与CD患者临床参数关系的分析显示，该基因CNV与患者性别、确诊年龄、病程、病变部位、疾病行为、贫血情况等均无相关性，但与吸烟史密切相关，有吸烟史者该基因拷贝数较无吸烟史者显著增加。吸烟是目前公认的CD发病的危险因素[12]，吸烟可抑制肠上皮细胞中的转录因子NF-κB活性、抑制NOD2基因转录和趋化因子CCL20、白细胞介素-8(IL-8)分泌[13]，导致肠黏膜对致病菌免疫反应异常和防御功能减弱，从而加重CD肠道炎症反应，故临床上建议CD患者必须戒烟。吸烟与CNTNAP3基因拷贝数扩增之间的确切关系需后期进一步探索。尽管本研究中外周血CNTNAP3基因拷贝数在不同病变部位CD间的差异未达统计学意义，但回结肠型和累及上消化道型CD的拷贝数有较单纯末端回肠型和单纯结肠型CD上调的趋势。本组患者按病变部位分层后各亚组例数较少，可能影响结果判断，CD病变部位与CNTNAP3基因拷贝数之间的相关性有待后续扩大样本量求证。

本研究对外周血CNTNAP3基因拷贝数扩增CD患者行血浆CNTNAP3水平检测，发现这部分患者的血浆CNTNAP3水平与正常对照组间差异无统计学意义。对这部分患者血浆CNTNAP3水平与部分临床参数关系的分析显示，其与患者年龄、BMI、SES-CD均无相关性。CNTNAP3主要是一种膜蛋白而非分泌性蛋白，在神经系统内的细胞识别中发挥作用，由此推测可能只有极少部分的CNTNAP3蛋白以血浆游离形式存在，因此无法根据血浆CNTNAP3水平区分CD患者与健康人。由于本研究样本量较小，此结果有待后续扩大样本量进行验证，并通过分层分析研究CNTNAP3是否在某些特定CD人群的外周血中存在异于一般人群的特殊表达。

对一些复杂疾病的研究发现，尽管CNVs不是惟一的致病途径，但确实可导致不同程度的基因表达差异，在疾病发生、发展中起重要作用[4-5]。本研究利用CNV相关研究方法发现，CNTNAP3基因拷贝数扩增可能参与了中国CD人群的发病，而激素治疗和吸烟可能是影响该基因CNV的因素；血浆CNTNAP3水平不能用于区分CD患者与健康人。上述发现为CD发病机制的研究以及寻求更有效的临床治疗途径提供了线索。期待未来会有更多研究对这一结论进行验证。

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(2017-03-03收稿；2017-04-11修回)

CNTNAP3 Copy Number Variation and its Significance in Crohn’s Disease

HUANGMeilan1,QIAOYuqi2,SHENJun2,CAIChenwen2,XUXitao2,CHENShengliang1,RANZhihua2.

1DivisionofGastroenterologyandHepatology,SouthRenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(201112);2DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease;ShanghaiInflammatoryBowelDiseaseResearchCenter,Shanghai

Correspondence to: RAN Zhihua, Email: ranzhihua1962@163.com

Inflammatory Bowel Disease; Crohn Disease; DNA Copy Number Variations; CNTNAP3 Gene; Comparative Genomics

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.002

国家自然科学基金(81500422)

#Email: melania000@163.com

&本文通信作者，Email: ranzhihua1962@163.com