Th1、Th2和Th17细胞失衡与克罗恩病的关系*

夏盛隆 薛战雄 蔡振寨 夏宣平 汤一冰 蒋 益&

温州医科大学附属第二医院消化内科1(325000) 病理科2



Th1、Th2和Th17细胞失衡与克罗恩病的关系*

夏盛隆1#薛战雄1蔡振寨1夏宣平1汤一冰2蒋 益1&

温州医科大学附属第二医院消化内科1(325000) 病理科2

背景：免疫功能紊乱是炎症性肠病发病的关键环节，研究发现Th1、Th2和Th17细胞比例失衡与肠道免疫失调相关。目的：探讨Th1、Th2和Th17细胞失衡与克罗恩病(CD)的关系。方法：收集2013年1月—2014年12月温州医科大学附属第二医院收治的CD患者36例，同期行肠息肉摘除术患者40例作为对照组，分别取病变部位肠组织和正常肠组织，采用real-time PCR和免疫组化法检测Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子(T-bet、GATA-3、RORγt)和细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17A)表达。结果：与对照组相比，CD组肠组织中T-bet、RORγt mRNA表达、IFN-γ、IL-17A mRNA和蛋白表达以及代表Th1/Th2、Th17/Th2比例的T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值均显著增高(P<0.05)，各转录因子与相应细胞因子表达呈显著正相关(P<0.05)。IFN-γ和IL-17A免疫阳性物质均定位于细胞质，在CD患者中阳性细胞主要分布于上皮层和黏膜固有层。分层分析显示活动期CD的上述指标均显著高于缓解期(P<0.05)；活动期CD代表Th17/Th1比例的RORγt/T-bet比值亦较缓解期显著增高(P<0.05)。结论：肠组织中Th1、Th2和Th17细胞失衡与CD密切相关，Th1、Th17细胞极化可能在其中起重要作用，活动期CD以Th17细胞极化为著。

Crohn病； Th1细胞； Th2细胞； Th17细胞

传统观点认为克罗恩病(Crohn’s disease, CD)主要是由Th1型免疫反应介导，与Th2细胞分泌的白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-13等细胞因子无关。近年来，随着Th17细胞的发现，一些学者提出Th17细胞极化可能是炎症性肠病(IBD)的发病机制之一[1-2]，但亦存在不同观点[3]。如有研究发现，以IL-17A抗体拮抗Th17细胞功能非但不能诱导CD临床缓解，还可能导致炎症进展[4]；经治疗获得临床缓解的CD患者，外周血Th17细胞比例反而显著高于活动期[5]。一项对德国IBD患者的研究[6]显示，在活动期IBD患者炎症黏膜中特异性聚集的Th17细胞兼有Th1细胞特性[干扰素-γ(IFN-γ)+IL-17+CD4+T细胞]。对意大利CD患者的研究[7]发现，病程较长的CD患者病变肠黏膜中Th1、Th2、Th17型细胞因子表达均显著上调。本研究拟检测浙江地区汉族CD患者肠组织中的Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子(T-bet、GATA-3、RORγt)和细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17A)表达水平，并分析其比例失衡与CD的关系，以期为深入揭示CD的免疫学发病机制提供依据。

材料与方法

一、研究对象

收集2013年1月—2014年12月温州医科大学附属第二医院消化内科收治的CD患者36例，其中男性16例，女性20例，平均年龄(31.22±5.88)岁，CD诊断参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[8]中的诊断标准，经临床、实验室、影像学、内镜、组织病理学检查综合确立。疾病活动性的评估采用简化CD活动指数(CDAI)[8]，入组患者缓解期(≤4分)10例，活动期(≥5分)26例。同期选取于该院行肠息肉摘除术的患者40例作为对照组，其中男性19例，女性21例，平均年龄(30.61±6.13)岁，经相关检查排除感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病。两组受试者均为相互间无血缘关系的浙江地区汉族居民，性别构成和平均年龄差异无统计学意义(P>0.05)。研究方案经医院伦理委员会审核批准，受试者均签署知情同意书。

二、方法

1. 标本采集：CD患者取病变部位肠组织，对照组肠息肉患者取相同部位正常肠组织，一部分以 0.9%NaCl溶液反复冲洗后液氮快速冷却，-80 ℃冰箱保存，用于real-time PCR；另一部分4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，制作病理切片。

2. Real-time PCR检测Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子、细胞因子表达：以TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)提取肠组织总RNA，检测RNA纯度和浓度，使用逆转录试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)逆转录合成cDNA，以之为模板行real-time PCR，引物由武汉谷歌生物科技有限公司设计、合成(表1)。25 μL反应体系中含cDNA 2.5 μL、上下游引物各1.0 μL、2×SYBR Green qPCR Mix(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)12.5 μL和适 量去离子水。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次。2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子和细胞因子PCR引物序列

目的基因引物序列β-actinF5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’ (内参)R5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3’T-betF5’-TGTGACCCAGATGATTGTGC-3’R5’-TGGAAAGTAAAGATATGCGTGTT-3’GATA-3F5’-CGAGATGGCACGGGACACTA-3’R5’-TGGTCTGGATGCCTTCCTTCTT-3’RORγtF5’-GAAGTGGTGCTGGTTAGGATGT-3’R5’-TTGCAGAGATGATGATGAAAGG-3’IFN-γF5’-CAGCTCTGCATCGTTTTGGG-3’R5’-GTTCCATTATCCGCTACATCTGAA-3’IL-4F5’-CCACAGGCACAAGCAGCTG-3’R5’-CAGGCCCCAGAGGTTCCT-3’IL-17AF5’-ATGGGGAAAATGAAACCCTC-3’R5’-TCAGCTCCTTTCTGGGTTGT-3’

3. 免疫组化法检测Th1、Th2、Th17细胞相关细胞因子表达：肠组织石蜡包埋，5 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，枸橼酸抗原修复液95 ℃ 40 min，3% H2O225 min，5%山羊血清封闭，滴加鼠抗人IFN-γ、IL-4、IL-17A抗体(1∶20稀释，Santa Cruz Biotechnology)，4 ℃过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照，PBS冲洗切片3次，滴加HRP标记山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，37 ℃ 50 min，PBS洗涤，DAB显色，苏木精复染，二甲苯脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察。细胞质或细胞核中出现棕黄色免疫阳性物质为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野(×200)，Image-Pro Plus 6.0软件进行半定量分析。目的蛋白相对表达量以阳性区域积分光密度值(IOD)与阳性面积(μm2)的比值表示。

三、统计学分析

结 果

一、Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子表达

Real-time PCR检测显示，CD组肠组织中T-bet、RORγt mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，两组间GATA-3 mRNA相对表达量差异无统计 学意义(P>0.05)；活动期CD T-bet、RORγt mRNA相对表达量显著高于缓解期(P<0.05)，两亚组间GATA-3 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。上述结果表明CD患者尤其是活动期CD患者肠组织中有大量Th1、Th17细胞浸润。

二、Th1、Th2、Th17细胞相关细胞因子表达

Real-time PCR检测显示，CD组肠组织中IFN-γ、IL-17A mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，两组间IL-4 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；活动期CD IFN-γ、IL-17A mRNA相对表达量显著高于缓解期(P<0.05)，两亚组间IL-4 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

免疫组化法检测显示，IFN-γ、IL-4、IL-17A免疫阳性物质均定位于细胞质，蛋白表达在CD组和对照组中的趋势与mRNA表达一致。在CD患者的肠组织中，IFN-γ+、IL-17A+细胞主要分布于上皮层和黏膜固有层，表达强度显著高于对照组(P<0.05)，其中活动期CD又显著高于缓解期(P<0.05)；IL-4在CD组和对照组肠组织中均为少量棕黄色表达，CD组与对照组间、活动期与缓解期CD间表达强度差异均无统计学意义(P>0.05)。上述结果进一步证实CD患者肠组织中有大量Th1、Th17细胞浸润，相关细胞因子表达水平显著上调，以活动期CD为著(表2、图1)。

三、Th1、Th2、Th17细胞失衡与CD的关系

Spearman秩相关系数分析显示，CD患者肠组织中的T-bet、GATA-3、RORγt mRNA表达分别与INF-γ、IL-4、IL-17A mRNA表达呈显著正相关(r=0.551,P=0.012;r=0.621,P=0.027;r=0.542,P=0.002)。分别以T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3和RORγt/T-bet比值表示Th1/Th2、Th17/Th2和Th17/Th1比例，结果显示T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值显著高于对照组(P<0.05)，两组间RORγt/T-bet比值差异无统计学意义(P>0.05)，提示Th1、Th17细胞极化与CD密切相关；与缓解期CD相比，活动期CD不仅T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值显著增高(P<0.05)，RORγt/T-bet比值亦显著增高(P<0.05)，表明活动期CD肠组织中Th1、Th17细胞增多且以Th17细胞为著(表3)。

表1 肠组织Th1、Th2、Th17细胞相关转录因子表达

表2 肠组织Th1、Th2、Th17细胞相关细胞因子表达

图1 对照组和CD组肠组织IFN-γ、IL-4、IL-17A免疫组化染色(×200)

讨 论

免疫功能紊乱是IBD发病的关键环节，研究发现Th1、Th2和Th17细胞比例失衡与肠道免疫失调有密切关联[9]，效应CD4+T细胞异常活化是导致肠黏膜免疫反应异常及其后续炎症反应的重要机制之一， 幼稚T细胞向不同方向极化后产生的相应细胞因子反应是决定IBD发生、发展和转归的重要病理生理因素。Th1和Th2细胞是CD4+T细胞中较早 被发现的亚群。通常认为抗原呈递细胞分泌IFN-γ后作用于幼稚T细胞上的转录因子STAT1，后者转移至细胞核内激活Th1细胞特异性转录因子T-bet，促进幼稚T细胞向Th1细胞分化。Th1细胞主要分泌INF-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-2等促炎细胞因子，增强免疫细胞杀伤细胞内病原体的能力。在IL-4的作用下，幼稚T细胞内转录因子GATA-3激活，通过下游靶基因表达使幼稚T细胞向Th2细胞分化，后者主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子。Th2细胞可诱导机体产生特异性抗体以清除细胞外病原体，并协助激活B细胞调节体液免疫。Th17细胞是一类具有与Th1、Th2细胞亚群不同分化机制和功能特征的新型CD4+T细胞亚群，RORγt和RORα是调控其分化进程的关键转录因子(RORα主要起协同RORγt的作用)，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等，在诱导TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子、CXC趋化因子、基质金属蛋白酶(MMPs)表达，以及中性粒细胞的增殖、成熟、趋化等过程中发挥重要作用[3,10]。尽管Th1、Th2、Th17细胞因转录因子和功能特征不同而被归为不同CD4+T细胞亚群，但三者在分化和功能上相互制约、相互影响，共同维持机体免疫稳态。

表3 肠组织Th1/Th2、Th17/Th2、Th17/Th1细胞比例

本研究real-time PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，CD患者肠组织中Th1、Th17细胞相关转录因子(T-bet、RORγt)和细胞因子(IFN-γ、IL-17A)表达均较对照组显著上调，分别代表Th1/Th2、Th17/Th2比例的T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值亦较对照组显著增高，提示Th1、Th17细胞极化与CD密切相关，与既往国内外研究报道的Th1、Th17细胞在CD发病中起重要作用的观点相符[11-13]。理论上，肠组织中Th1、Th17细胞数量异常增多将促进IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-17F等促炎细胞因子分泌，激活NF-κB等炎症信号通路，诱导或加重肠道炎症反应。值得注意的是，本研究并未发现代表Th17/Th1细胞比例的RORγt/T-bet比值在CD患者与对照者之间存在显著差异，而Li等[14]的研究却发现CD患者肠黏膜固有层CD4+T细胞中Th17细胞比例显著增高，Th1细胞比例显著降低，与本研究结果不符，可能与研究对象临床病理特征不同以及T细胞亚群检测方法的差异有关。

本研究进一步分析了活动期与缓解期CD间Th1、Th2、Th17细胞比例的差异，结果显示活动期CD肠组织中Th1、Th17细胞相关转录因子、细胞因子表达和Th1/Th2、Th17/Th2比例均较缓解期进一步增高。令人感兴趣的是，与缓解期CD相比，活动期CD代表Th17/Th1比例的RORγt/T-bet比值亦显著增高，表明疾病活动期时Th17细胞极化较Th1细胞更为明显。既往国内外较多研究[1-2,11-13,15]发现CD患者外周血或肠组织中的Th1、Th17细胞比例或数量与疾病活动性呈正相关。然而亦有研究结果持不同观点。加拿大一项研究[14]表明，CD患者肠黏膜固有层Th1细胞比例与内镜疾病活动性评分Rutgeerts评分无相关性，以英夫利昔单抗诱导CD临床缓解后，Th1细胞比例未见明显改变。丹麦学者Dige等[5]报道，活动期CD患者以阿达木单抗诱导临床缓解后，外周血中IL-17A+IL-21+Th17细胞比例较活动期增加2～3倍。Raza等[16]的研究结果则显示CD患者外周血单核细胞分泌的IL-17A水平与疾病活动性无关。一项随机双盲安慰剂对照临床试验甚至发现，人IL-17A单克隆抗体苏金单抗(secukinumab)用于中重度活动期CD患者的诱导缓解治疗不仅无效，甚至可升高炎症指标血清C-反应蛋白和粪乳铁蛋白水平[4]。因此，Th1、Th17细胞极化与CD疾病活动性的关系仍有待进一步研究。

综上所述，本研究结果表明肠组织中Th1、Th2、Th17细胞失衡与浙江地区汉族人群CD发病和病情进展密切相关，Th1、Th17细胞极化可能在其中起重要作用，活动期CD 以Th17细胞极化为著。本研究采用肠息肉患者的正常肠组织作为对照，尽管目前尚无证据认为肠息肉的发生、发展与CD4+T细胞亚群失衡有关，但此对照设置仍可能存在潜在偏倚。后续拟纳入行结肠镜检查的健康体检者作为对照以进一步明确CD4+T细胞亚群失衡与CD发病的确切关系。

1 高楠，戴娟，张光波，等. 外周血 Th17细胞在炎症性肠病活动度评估中的临床意义[J]. 胃肠病学, 2015, 20 (12): 713-716.

2 刘雪平，王轶，赵治彬，等. 炎症性肠病患者外周血Th17细胞的变化及其临床意义[J]. 胃肠病学, 2010, 15 (5): 284-287.

3 Monteleone I, Sarra M, Pallone F, et al.Th17-related cytokines in inflammatory bowel diseases: friends or foes?[J]. Curr Mol Med, 2012, 12 (5): 592-597.

4 Hueber W, Sands BE, Lewitzky S, et al; Secukinumab in Crohn’s Disease Study Group. Secukinumab, a human anti-IL-17A monoclonal antibody, for moderate to severe Crohn’s disease: unexpected results of a randomised, double-blind placebo-controlled trial[J]. Gut, 2012, 61 (12): 1693-1700.

5 Dige A, Støy S, Rasmussen TK, et al. Increased levels of circulating Th17 cells in quiescent versus active Crohn’s disease[J]. J Crohns Colitis, 2013, 7 (3): 248-255.

6 Globig AM, Hennecke N, Martin B, et al. Comprehensive intestinal T helper cell profiling reveals specific accumulation of IFN-γ+IL-17+coproducing CD4+ T cells in active inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2014, 20 (12): 2321-2329.

7 Zorzi F, Monteleone I, Sarra M, et al. Distinct profiles of effector cytokines mark the different phases of Crohn’s disease[J]. PLoS One, 2013, 8 (1): e54562.

8 中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组. 炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)[J]. 胃肠病学, 2012, 17 (12): 763-781.

9 Strober W, Fuss IJ.Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J]. Gastro-enterology, 2011, 140 (6): 1756-1767.

10 关家喜，周宇. Th17细胞在炎症性肠病发病机制作用的研究进展[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2012, 21 (2): 114-117.

11 戴娟，张光波，高楠，等. 炎症性肠病患者外周血辅助性T细胞1和辅助性T细胞17水平及其临床意义[J]. 中华内科杂志, 2013, 52 (5): 375-378.

12 Olsen T, Rismo R, Cui G, et al.TH1 and TH17 interactions in untreated inflamed mucosa of inflammatory bowel disease, and their potential to mediate the inflammation[J]. Cytokine, 2011, 56 (3): 633-640.

13 Chao K, Zhang S, Yao J, et al.Imbalances of CD4(+) T-cell subgroups in Crohn’s disease and their relationship with disease activity and prognosis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2014, 29 (10): 1808-1814.

14 Li J, Ueno A, Fort Gasia M, et al. Profiles of Lamina Propria T Helper Cell Subsets Discriminate Between Ulcerative Colitis and Crohn’s Disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2016, 22 (8): 1779-1792.

15 Iboshi Y, Nakamura K, Ihara E, et al.Multigene analysis unveils distinctive expression profiles of helper T-cell-related genes in the intestinal mucosa that discriminate between ulcerative colitis and Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2014, 20 (6): 967-977.

16 Raza A, Ahmed K, Navaneethan U, et al. The levels of IL-17 secreted by Lipopolysaccharide-stimulated Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in Inflammatory Bowel Disease (IBD) patients significantly correlated with disease severity in Ulcerative colitis but not in Crohn’s disease[J]. Am J Gastroenterol, 2011, 2s: S486.

(2016-12-11收稿；2017-01-16修回)

Imbalance among Th1, Th2 and Th17 Cells and Crohn’s Disease

XIAShenglong1,XUEZhanxiong1,CAIZhenzhai1,XIAXuanping1,TANGYibing2,JIANGYi1.

1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou,ZhejiangProvince(325000)

Correspondence to: JIANG Yi, Email: wzjiangyi@yeah.net

Background: Dysregulated immune response is crucial for the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Recent studies suggested that imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells was closely related to the aberrant intestinal immune response. Aims: To investigate the association of imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells and Crohn’s disease (CD). Methods: Thirty-six CD patients admitted from Jan. 2013 to Dec. 2014 at the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University were enrolled; 40 patients undergoing intestinal polypectomy were collected as controls. Inflamed and normal mucosal tissues were obtained from CD patients and the controls, respectively; expressions of Th1, Th2 and Th17 cells related transcriptional factors (T-bet, GATA-3 and RORγt) and cytokines (IFN-γ, IL-4 and IL-17A) were determined by real-time PCR and immunohistochemistry. Results: In comparison with the controls, mRNA expression of T-bet and RORγt, mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17A, as well as the ratios for T-bet/GATA-3 and RORγt/GATA-3, which represented balance of Th1/Th2 and Th17/Th2, respectively, were all significantly increased in inflamed mucosal tissue in CD patients (P<0.05). Expression of each of the three transcriptional factors was positively correlated with its corresponding cytokine (P<0.05). IFN-γ+and IL-17A+cells mainly located in the intestinal epithelial layer and lamina propria with cytoplasmic immunoreactivities in CD patients. In the stratified analysis, all the above-mentioned parameters were significantly higher in active CD than in inactive CD (P<0.05); furthermore, the ratio for RORγt/T-bet, which represented balance of Th17/Th1, was also increased significantly in active CD (P<0.05). Conclusions: Imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells in intestinal mucosal tissue was closely related with CD. Polarization of Th1 and Th17 cells are involved in this process, and Th17 polarization is predominant in active disease.

Crohn Disease; Th1 Cells; Th2 Cells; Th17 Cells

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.003

浙江省自然科学基金(LY14H030012，LY15H030018，LY16H160055，LY17H030011)；浙江省卫生科技计划资助项目(2012KYA132)；温州市科技局资助项目(Y20160102)

#Email: 526315332@qq.com

&本文通信作者，Email: wzjiangyi@yeah.net