体内外高脂对肝脏NLRP3炎性小体相关基因表达的影响*

隋永恒 连 敏 华 静

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种与内脏型肥胖、胰岛素抵抗以及遗传易感因素密切相关的临床病理综合征，其发 病率逐年上升，已成为我国继慢性乙型肝炎之后 的主要肝病类型[1-2]。炎症-免疫系统活化是NAFLD发生、发展的重要机制。炎性小体是一种由细胞感染或应激激活的蛋白复合体，通过激活caspase-1介导促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-1β成熟，启动固有免疫应答[3]。目前发现的炎性小体主要包括NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2，相关研究主要集中于对NLRP3炎性小体的探索，其能被分子、细菌或病毒激活，在诸多疾病中发挥关键作用[3]。近年研究发现，炎性小体在多种肝脏疾病的发病机制中居重要地位[4]。本研究以高脂饮食建立NAFLD小鼠模型，并在体外以不同种类脂肪酸处理原代肝细胞，探讨体内外高脂处理对肝脏NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、caspase-1、IL-1β表达的影响。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠由上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心提供。D-Hanks液、DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；Ⅰ型和Ⅳ型胶原酶、台盼蓝染料、棕榈酸(palmitic acid, PA)、油酸(oleic acid, OA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型购自上海创赛科学仪器有限公司；油红O染料购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自日本Takara公司；PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗鼠NLRP3多克隆抗体购自英国Abcam公司；兔抗鼠GAPDH单克隆抗体、HRP偶联羊抗兔IgG购自上海康成生物工程有限公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

二、方法

1. 分组和模型建立：30只6～8周龄C57BL/6J小鼠(体质量19～20 g)随机分为高脂饮食组(n=20)和对照组(n=10)，高脂饮食组给予高脂饮食(热量来源：脂肪59%，碳水化合物25%，蛋白质16%)，对照组给予正常饮食(热量来源：脂肪12%，碳水化合物59%，蛋白质29%)。喂饲16周后处死小鼠，取肝组织液氮冷冻或4%甲醛溶液固定待测。

2. 肝组织病理学检查：取肝组织标本，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学表现。

3. 肝细胞分离培养：8周龄正常饮食C57BL/6J小鼠以4%水合氯醛麻醉，分离门静脉，24G留置针穿刺插管固定，以D-Hanks液灌注，至肝脏呈土黄色后改为灌注含0.025%Ⅰ型胶原酶和0.05% Ⅳ型胶原酶的DMEM溶液20 min。分离肝脏，剪碎肝组织，置于含胶原酶的DMEM溶液中消化10 min，以100目不锈钢滤网过滤，获得细胞悬液，离心(500×g,7 min)后PBS清洗2次。台盼蓝染色检测细胞活率>85%，调整细胞浓度至2×106/mL，接种于铺有鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的培养皿，以含10%胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2培养箱内培养6 h，洗去未贴壁细胞。

4. 体外游离脂肪酸处理原代肝细胞：原代肝细胞分离培养6 h后换液，以含不同种类脂肪酸(PA 0.25 mmol/L，OA 0.25 mmol/L，DHA 0.05 mmol/L)的DMEM培养液培养，对照组原代肝细胞以DMEM培养液培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱内分别培养6、20、24 h。另取原代肝细胞，以含LPS 1000 ng/mL的DMEM培养液培养24 h。洗去培养液，收集细胞待测。

5. 肝细胞油红O染色：取经脂肪酸(PA、OA、DHA)处理20 h的肝细胞和相同培养时间的对照组肝细胞，4%甲醛溶液固定30 min，油红O避光染色30 min，60%异丙醇冲洗2 s，蒸馏水清洗30 s，苏木素染色25 s，明胶封片，光学显微镜下观察细胞内脂质沉积。

6. Real-time PCR法：取肝组织、经脂肪酸(PA、OA、DHA)处理6 h的肝细胞以及相同培养时间的对照组肝细胞，以Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，行real-time PCR检测。NLRP3引物上游：5’-GAG TTC TTC GCT GCT ATG T-3’，下游：5’-ACC TTC ACG TCT CGG TTC-3’；caspase-1引物上游：5’-TGG AGA GAA ACA AGG AG-3’，下游：5’-TTG AAG AGC AGA AAG CAA T-3’；IL-1β引物上游：5’-TCT TTG AAG TTG ACG GAC CC-3’，下游：5’-TGA GTG ATA CTG CCT GCC TG-3’；β-actin引物上游：5’-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3’，下游：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。以2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

7. 蛋白质印迹法：取经脂肪酸(PA、OA、DHA)、LPS处理24 h的肝细胞以及相同培养时间的对照组肝细胞，以细胞裂解液抽提细胞总蛋白，取蛋白样品行SDS-PAGE电泳，湿法电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入兔抗鼠NLRP3多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗鼠GAPDH单克隆抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，室温复温30 min，TBS清洗，加入HRP偶联羊抗兔IgG(1∶10 000)，室温孵育1 h，加入ECL发光剂显色，置暗盒X线曝光，常规显影、定影。

三、统计学分析

结 果

一、高脂饮食对小鼠肝组织病理学表现的影响

高脂饮食组小鼠肝组织内可见大量空泡样脂肪变性，未见明显炎性细胞浸润；对照组小鼠肝组织未见明显异常(见图1)。

二、体外高脂处理对肝细胞内脂质沉积的影响

油红O染色结果显示，对照组肝细胞内可见少量脂质沉积，PA组肝细胞内可见大量脂质沉积，OA和DHA组肝细胞内可见中等量脂质沉积(见图2)。

三、高脂饮食对肝组织NLRP3炎性小体相关基因表达的影响

Real-time PCR法检测结果显示，与对照组相比，高脂饮食组小鼠肝组织内NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA表达显著增高(P<0.05)(见图3)。

A：对照组；B：高脂饮食组

A：对照组；B：PA组；C：OA组；D：DHA组

*与对照组比较，P<0.05

四、脂肪酸对肝细胞NLRP3炎性小体相关基因表达的影响

Real-time PCR法检测结果显示，PA组肝细胞NLRP3和IL-1β mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)，而DHA组NLRP3和IL-1β mRNA表达显著低于对照组(P<0.05)，OA组两者表达与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。三组caspase-1 mRNA表达与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)(见图4)。

*与对照组比较，P<0.05

五、脂肪酸对肝细胞NLRP3蛋白表达的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，PA、OA组NLRP3蛋白表达较LPS组升高，DHA组NLRP3蛋白表达较LPS组降低(见图5)。

图5 脂肪酸对肝细胞NLRP3蛋白表达的影响

讨 论

肝脏是体内脂质代谢的主要场所，肝内脂质过度或异常沉积是引起NAFLD的重要原因。研究发现，炎症相关信号途径活化是NAFLD发展至非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)的重要因素[5]。近年研究[6-7]显示，炎性小体基因缺失小鼠由高脂饮食诱导的肝脏损伤、胰岛素抵抗延缓，炎性小体介导的促炎细胞因子活化在NAFLD发生、发展中的作用日益受到重视。

本研究以高脂饮食喂饲小鼠16周建立NAFLD模型，发现小鼠肝组织存在显著脂肪变性，肝组织中NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA 表达较正常饮食小鼠明显增高。Csak等[8]的研究却发现，以高脂饮食喂饲小鼠4周后，其肝组织中NLRP3炎性小体相关基因表达与正常饮食小鼠相比无明显差异。本课题组既往研究[9]发现，短期(4～6周)高脂饮食喂饲小鼠并不引起肝细胞内明显脂质沉积，喂饲8～12周后，肝细胞内可见显著脂肪变性。由此可见，肝细胞内脂质沉积是炎性小体表达增加的前提。研究指出，NLRP3炎性小体既可由病原体相关分子模式激活，也可由危险相关分子模式激活[3,10]。细胞内脂肪酸过度沉积被认为是内源性危险相关分子模式，可启动炎症反应[11]。由此推测，脂肪酸水平升高、肝内显著脂肪变性可能启动了内源性危险相关分子模式介导的NLRP3炎性小体相关基因表达。

游离脂肪酸作为NAFLD发展中一个早期且至关重要的因素，在高脂饮食诱导的小鼠和遗传性肥胖个体中均明显升高。脂肪酸水平升高和肝细胞内脂质过度沉积是NAFLD的特征性表现。本研究通过体外不同种类脂肪酸处理模拟体内高脂环境，观察脂肪酸对肝细胞内脂质沉积和炎性小体表达的影响。油红O染色结果显示，不同种类脂肪酸中以饱和脂肪酸PA诱导肝细胞内脂质沉积的效应最为显著。同时real-time PCR法检测结果显示，经PA处理的肝细胞，NLRP3和IL-1β mRNA表达较对照组显著升高，而经多不饱和脂肪酸DHA处理的肝细胞，NLRP3和IL-1β mRNA表达较对照组显著降低。蛋白质印迹法检测结果显示，PA处理可致肝细胞NLRP3蛋白表达增加，DHA处理则降低NLRP3蛋白表达。提示不同种类的脂肪酸对炎性小体具有不同影响，饱和脂肪酸引起肝内NLRP3炎性小体表达增加，活化相关炎症反应，而多不饱和脂肪酸则具有相反的效应。DHA是一种ω-3多不饱和脂肪酸，在抗炎和免疫应答反应中发挥调控作用。本课题组既往研究[12]证实，喂饲富含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸饮食可引起小鼠肝脏显著脂肪变性以及炎症-免疫系统活化，而喂饲富含多不饱和脂肪酸饮食则无上述影响。体外细胞学研究[13]证实，高浓度ω-3多不饱和脂肪酸可显著降低LPS诱导的单核细胞NF-κB活化，减少肿瘤坏死因子(TNF)-α产生。Schmöcker等[14]的研究发现，肝组织中内源性ω-3多不饱和脂肪酸含量增加可降低肝内多种炎性因子的表达，从而缓解D-氨基半乳糖/LPS诱导的急性肝损伤。上述研究提示，多不饱和脂肪酸具有抗炎作用，可降低NLRP3炎性小体表达，抑制炎症反应可能是其保护肝细胞的重要机制之一。

NLRP3炎性小体的活化机制尚不明确。目前认为，炎性小体活化需两种信号介导，一种信号诱导炎性小体成分基因表达上调，另一种信号促进炎性小体成分装配以及功能活化。LPS联合脂肪酸可诱导肝脏Kupffer细胞激活炎性小体，而脂肪酸单独作用于Kupffer细胞并不引起炎性小体活化[15]。然而，本研究发现单独以饱和脂肪酸PA处理肝细胞亦可引起NLRP3基因和蛋白表达升高，推测在肝细胞中饱和脂肪酸可作为Toll样受体(TLRs)的配体介导炎性小体表达，而脂肪酸损伤的肝细胞释放的内源性物质可作为另一种配体活化炎性小体。

综上所述，肝内脂质尤其是饱和脂肪酸沉积可引起NLRP3炎性小体相关基因表达升高，促进肝脏局部炎症反应和NAFLD进展，而多不饱和脂肪酸可降低NLRP3炎性小体相关基因表达，可能具有抗炎、保护肝细胞的作用，相关机制有待进一步研究。

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