微探头共聚焦激光显微内镜临床应用进展

龚 帅 综述 戈之铮 审校

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy, CLE)是近年发展迅速的一种新型高端内镜。应用CLE观察病灶表面形态学结构的同时，还能观察黏膜组织学结构，避免活检组织病理学诊断等待的时间，提高靶向活检的准确性，实现即时“光学活检”的目的。CLE的出现对于消化内镜检查中“活检”的作用将具有深远影响。目前应用于临床的CLE主要分为两种形式：一种是将CLE镜头整合于普通白光内镜，形成整合式共聚焦激光显微内镜(endoscope-based CLE, eCLE)；另一种则是将可活动性微探头插入普通白光内镜活检钳道对靶组织进行检查，可与大多数不同种类的内镜相兼容，形成微探头式共聚焦激光显微内镜(probe-based CLE, pCLE)。目前pCLE已应用于Barrett食管(BE)、结直肠息肉、溃疡性结肠炎(UC)、不确定性胆管狭窄等疾病的研究中，但对其在消化道疾病以及其他相关学科中的应用价值仍存在争议。本文就pCLE的临床应用进展作一综述。

一、pCLE工作原理

1. 成像原理和设备参数：pCLE系统主要包括一台显示和处理图像的电脑工作站、激光扫描单元和一根微探头共聚焦激光显微内镜。成像时，通过主机激发出波长为488 nm、最大输出功率<1 mW的蓝光光束，经内部光纤传导，聚焦于微探头头端的靶组织。组织中的荧光对比剂在激光的激发下发出荧光，仅物镜共焦点平面发出的荧光才能通过探头孔到达探测器，外部主机通过一系列信号转导途径分析采集到的信号，得到相应层面的光学横断面图像。pCLE的扫描速度为12帧/s，共聚焦微探头的直径最大为2.5 mm，最小仅0.9 mm，能通过多数内镜的工作钳道，扫描范围为240～600 μm，光学层面厚度15 μm，侧面分辨率1～3.5 μm，成像深度为70～130 μm[1-2]。虽然pCLE的可视范围和侧面分辨率不及eCLE，但其可广泛用于各种不同普通内镜，更为轻便，操作更容易，而且能对更小空间的组织进行探测。

2. 荧光对比剂：行CLE检查时，组织自体荧光并不能进行充分对比，为采集到质量更佳的图像，需使用荧光对比剂。目前静脉注射荧光素钠在pCLE中应用最多。荧光素钠因相对廉价、无致畸性且能提高成像深度的特性，已在眼科中运用了数十年。一般静脉注射10%的荧光素钠5～10 mL后，逐渐渗入消化道黏膜全层，使成像范围从上皮表面深入至固有层(0～250 μm)，通过固有层结缔组织基质与微血管系统产生强烈对比，从而观察到单个细胞。与伊红染料类似，荧光素钠可对细胞质和细胞外基质进行染色，但不能清楚显示细胞核。有研究[3]显示，结肠检查中静脉注射5 mL 10%的荧光素钠，pCLE的图像质量最佳。

荧光对比剂的安全性问题逐渐引起关注。Wallace等[4]的一项纳入16个中心2 272例患者的大样本临床研究发现，静脉注射荧光素钠无严重不良事件发生，仅1.4%的患者出现轻微不良反应，包括一过性低血压、恶心、注射部位红肿、自限性弥漫性皮疹以及轻微上腹部疼痛等。

二、临床应用

1. BE：普通白光内镜诊断BE必须结合病理活检，但随机活检费时、费钱，且取样范围不到病灶表面积的10%，存在漏诊的风险，因此近二十年一些新的内镜技术不断应用于BE的诊断。近年大量研究证实CLE在诊断BE方面具有很高的价值。pCLE迈阿密分型中，正常鳞状上皮的特征包括不含隐窝和绒毛的扁平细胞、高亮的上皮内乳头毛细血管襻；非瘤变Barrett上皮表现为均一的绒毛状结构、柱状细胞和深黑的杯状细胞；高级别上皮内瘤变表现为绒毛状结构、黑而不规则的增厚上皮间隙以及不规则膨胀的脉管；食管腺癌的镜下特征为无序或缺乏绒毛状结构和隐窝、黑色柱状细胞和不规则膨胀的脉管[5]。

Pohl等[6]发现pCLE诊断BE患者肉眼不可见瘤变的特异性和阴性预测值较高(91%和98.8%)，但敏感性和阳性预测值较低。随后Bajbouj等[7]以四象限活检病理结果为金标准，扩大例数并完善诊断标准，结果仍显示pCLE诊断BE相关性瘤变的敏感性和阳性预测值较低，分别仅为28%和46%。导致上述结果原因可能为：其一纳入对象的BE相关性瘤变的发生率较低，其二研究制定的诊断标准太为严格。

由于以往研究均无法鉴定pCLE在诊断BE相关性瘤变中的真实价值，Sharma等[8]联合美国和欧洲专家首次进行了一项全球大型多中心、随机、对照、前瞻性研究。研究纳入了5个独立中心的101例最终受试者，以病理诊断为金标准，探讨了普通白光内镜、窄带成像内镜(NBI)和pCLE单独以及联合运用对诊断BE相关性瘤变的敏感性和特异性。结果显示普通白光内镜联合pCLE或NBI诊断的敏感性分别为68%、45%，特异性均为88%，三者联合运用的诊断敏感性高达76%。说明pCLE联合普通白光内镜可有效提高BE相关性瘤变的诊断率。

由于pCLE具有易于掌控、学习曲线短等优点，能更有效地指导BE患者随访和及时制定治疗方案。Johnson等[9]对4例病理证实为伴有高级别上皮内瘤变的BE患者行内镜下黏膜切除术(EMR)或射频消融术治疗，随后采用pCLE观察手术边界。结果显示1例患者的手术边缘仍有瘤变，立即再次行EMR；1例患者pCLE示非连续性BE，靶向活检结果证实为BE，随后行射频消融术治疗。说明在伴有瘤变的BE患者中，pCLE可很好地指导靶向活检和评估EMR或射频消融术等内镜下治疗的精准性。Bertani等[10]的研究亦证实pCLE可提高BE患者随访效率。

2. 胆管系统疾病：胆管系统疾病良恶性鉴别始终是医学界面临的一大难题。目前常用的检测方法包括胆管镜、刷式细胞学、荧光原位杂交、ERCP或超声内镜引导下的细针穿刺细胞学检查等，各种方法有其优点，但对胰胆管肿瘤尤其是不确定性肿瘤的诊断准确率均较低，目前急需寻找一种更便捷的方法以提高胰胆管病变的诊断率并减少不必要的手术治疗。Meining等[11]对14例胆管狭窄患者的研究发现，pCLE可显著提高胆管肿瘤的诊断敏感性，远高于传统组织活检(83%对50%)。随后一项大型多中心研究[12]对89例同时接受ERCP和pCLE的患者进行评估，最终40例确诊为癌症。pCLE诊断肿瘤性狭窄的总准确性和敏感性分别为81%和98%，且联合ERCP的准确性高于ERCP联合病理检查(90%对73%，P=0.001)。最后该研究小组[13]提出了鉴别良恶性胰胆管狭窄的pCLE图像特征，若存在增厚的白光带(>20 μm)、增厚的暗带(>40 μm)、上皮结构(绒毛状和腺体)、纠集的暗簇等表现，则高度提示恶性可能。Talreja等[14]的多中心研究发现，pCLE诊断不确定性胆管狭窄的观察者之间一致性为差-中，希望后续研究可完善诊断标准并加强临床医师对pCLE的学习，以提高诊断准确性。

3. 结直肠疾病：随着色素内镜、NBI和自发荧光内镜在常规结肠镜检查中的应用，结直肠疾病的诊断、分类以及良恶性鉴别有了重大进展，但均存在一定问题。CLE可实时观察细胞结构，为临床医师判定病变性质以及制定治疗措施提供有力依据。目前尚缺乏CLE诊断结直肠疾病的统一标准，运用较多的标准为美因兹标准和迈阿密分型。美因兹标准是由Kiesslich等[15]基于动物研究、病理学标准和其中心关于eCLE的研究经验制定的，主要分为正常黏膜、增生性病变、腺瘤性病变三大类。由于pCLE的扫描范围、分辨率、扫描速度与eCLE均不同，故对该标准应用于pCLE诊断结直肠疾病仍有很大争议。随后Wallace等[5]建立pCLE迈阿密分型，完善了结直肠息肉(增生性、腺瘤性)、UC和相关瘤变的诊断标准，但需更多研究来证实其诊断价值。

①结直肠息肉：常规结肠镜发现结直肠息肉并不难，主要鉴别要点为增生性息肉和腺瘤性息肉，两者的预后不同，因此处理原则迥异。增生性息肉大多无需处理，而腺瘤因癌变率较高，需行内镜下或手术治疗。目前已发现eCLE对结直肠息肉的诊断和良恶性的鉴别具有很高价值，而pCLE相关临床研究较少。Buchner等[16]研究了pCLE与不同电子染色内镜对结直肠息肉分型和具有癌变风险的较大息肉(≥10 mm)的诊断敏感性和特异性。以病理诊断为金标准，pCLE的敏感性较FICE更高(93%对73%，P=0.003)，但特异性无明显差异(86%对68%，P=0.22)；而pCLE的诊断敏感性和特异性与NBI均无明显差异。该研究推荐，pCLE对于较小的低级别瘤变性腺瘤样息肉可免除病理活检，直接指导切除方案；而对于pCLE明确诊断为增生性息肉者，可不予处理。Shahid等[17]发现 pCLE诊断结直肠息肉的敏感性较NBI更高，但特异性较低，两者的准确性均较高；pCLE联合NBI可将诊断准确性提高至95%，敏感性为94%，特异性为97%。同时，Shahid等[18]还对pCLE和NBI监测结直肠息肉EMR术后残余病灶的价值进行研究，结果证实两者均能很好地发现残余病灶，联合诊断的准确性为90%、敏感性100%、特异性87%，阴性预测值高达100%，可很好地避免非肿瘤性息肉过度治疗的手术风险和反复结肠镜检查费用。

②结直肠肿瘤性病变：De Palma等[19]发现结直肠肿瘤性病变在pCLE下表现为黑色肿瘤细胞，伴随黏液成分和杯状细胞减少；细胞结构不规则，绒毛状结构尚存，黑色增厚的上皮间隙；微血管扭曲扩张并伴有不规则分支。pCLE对结直肠肿瘤性病灶具有很高的诊断准确性、敏感性和特异性(92.3%、100%、84.6%)。然而Gómez等[20]的研究显示pCLE诊断结直肠肿瘤性病变的准确性仅为75%，敏感性和特异性分别为76%和72%。因此需更大型、多中心的研究来进一步证实pCLE诊断结直肠肿瘤性病变的价值。

最近Mascolo等[21]采用pCLE在9例受试者中发现了7例结肠异常隐窝病灶(ACF)，其在pCLE下图像特征为颜色较周围正常结肠黏膜更暗，腺窝腔增大2～3倍，边界隆起，伴或不伴有增厚上皮。由于ACF为结直肠肿瘤多步骤发生理论中最早期可识别的变化，从而可为早期诊断结直肠肿瘤提供一项新的特征。

③UC：UC患者发生肿瘤的风险增高，定期内镜随访、对可疑病灶行靶向活检显得尤为重要。常规白光内镜对肿瘤性病变检出率较低，通过染色内镜、自发荧光内镜和NBI内镜并行靶向活检能提高UC患者肿瘤性病灶的检出率。有关eCLE的研究表明其能较好地区分腺瘤样肿块(adenoma-like mass, ALM)和异型增生样病变(dysplasia-associated lesional mass, DALM)[22]。目前pCLE的相关研究少见，van den Broek等[23]对22例患者先后给予高分辨率内镜、NBI和pCLE检查，最后行靶向活检。最终发现pCLE诊断的敏感性、特异性和准确性分别为65%、82%和81%，低于高分辨率内镜联合NBI(分别为100%、89%和92%)。因此，尚需行进一步研究来证实pCLE在UC患者随访中的作用。

4. 胃十二指肠疾病：eCLE在慢性胃炎、幽门螺杆菌感染、早期和进展期胃癌、十二指肠息肉中均有较高的诊断价值，但有关pCLE在胃十二指肠疾病中应用的研究不多见。Pittayanon等[24]首次对放大内镜+FICE联合pCLE诊断胃黏膜肠化生的可行性进行了研究。pCLE下肠化生病灶表现为绒毛状胃上皮细胞、胃柱状上皮细胞被黑色杯状细胞取代。两者联合诊断的敏感性、特异性高达96.5%和90.5%，高于单独应用ME-FICE的95.6%和79.2%。Nakai等[25]以异硫氰酸荧光素标记的抗体作为荧光对比剂，采用pCLE检测猪食管和胃黏膜表皮生长因子受体(EGFR)和生存素的定位，结果发现EGFR和生存素富集于胃原始祖细胞和部分内皮细胞。由于EGFR在包括胃的众多肿瘤中呈高表达，且在肿瘤增殖、血管生成、侵袭和转移中具有重要作用，因此通过pCLE监测EGFR表达的部位，对于早期胃癌的诊断、靶向活检和治疗均具有重要意义。

十二指肠腺瘤是最常见的十二指肠肿瘤，目前仅通过病理活检确诊，但可能会导致出血、胰腺炎、穿孔等并发症。Shahid等[26]将NBI和pCLE联合用于十二指肠息肉的诊断，结果显示敏感性、特异性和准确性提高至95%、90%和92%，为减少活检风险和指导治疗带来了革命性意义。

三、结语

pCLE将实时诊断范围延伸至细胞甚至是亚细胞水平，并能应用于更小的检查空间，对于消化内镜技术的发展具有深远意义。随着该项技术日渐成熟，除用于胃食管疾病、结直肠息肉、炎症性肠病、胆管系统疾病和胰腺肿瘤外，新近有报道发现pCLE在支气管镜和膀胱镜检查中亦有重要诊断价值[27-28]。虽然pCLE在图像清晰度、扫描范围、成像深度等方面仍存在局限性，但随着新型荧光对比剂和分子标记物如荧光标记的抗体、多肽、连接有单克隆抗体的金原子纳米团以及5-羧基二乙酸荧光素等的应用，pCLE在靶向诊断、指导活检和治疗中的作用必将越来越突显。

1 Paull PE, Hyatt BJ, Wassef W, et al. Confocal laser endomicroscopy: a primer for pathologists[J]. Arch Pathol Lab Med, 2011, 135 (10): 1343-1348.

2 Wallace MB, Fockens P. Probe-based confocal laser endomicroscopy[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (5): 1509-1513.

3 Shahid MW, Crook JE, Meining A, et al. Exploring the optimal fluorescein dose in probe-based confocal laser endomicroscopy for colonic imaging[J]. J Interv Gastroenterol, 2011, 1 (4): 166-171.

4 Wallace MB, Meining A, Canto MI, et al. The safety of intravenous fluorescein for confocal laser endomicroscopy in the gastrointestinal tract[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2010, 31 (5): 548-552.

5 Wallace M, Lauwers GY, Chen Y, et al. Miami classification for probe-based confocal laser endomicroscopy[J]. Endoscopy, 2011, 43 (10): 882-891.

6 Pohl H, Rösch T, Vieth M, et al. Miniprobe confocal laser microscopy for the detection of invisible neoplasia in patients with Barrett’s oesophagus[J]. Gut, 2008, 57 (12): 1648-1653.

7 Bajbouj M, Vieth M, Rösch T, et al. Probe-based confocal laser endomicroscopy compared with standard four-quadrant biopsy for evaluation of neoplasia in Barrett’s esophagus[J]. Endoscopy, 2010, 42 (6): 435-440.

8 Sharma P, Meining AR, Coron E, et al. Real-time increased detection of neoplastic tissue in Barrett’s esophagus with probe-based confocal laser endomicroscopy: final results of an international multicenter, prospective, randomized, controlled trial[J]. Gastrointest Endosc, 2011, 74 (3): 465-472.

9 Johnson EA, De Lee R, Agni R, et al. Probe-based confocal laser endomicroscopy to guide real-time endoscopic therapy in Barrett’s esophagus with dysplasia[J]. Case Rep Gastroenterol, 2012, 6 (2): 285-292.

10 Bertani H, Frazzoni M, Dabizzi E, et al. Improved detection of incident dysplasia by probe-based confocal laser endomicroscopy in a Barrett’s esophagus surveillance program[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58 (1): 188-193.

11 Meining A, Frimberger E, Becker V, et al. Detection of cholangiocarcinomainvivousing miniprobe-based confocal fluorescence microscopy[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2008, 6 (9): 1057-1060.

12 Meining A, Chen YK, Pleskow D, et al. Direct visualization of indeterminate pancreaticobiliary strictures with probe-based confocal laser endomicroscopy: a multicenter experience[J]. Gastrointest Endosc, 2011, 74 (5): 961-968.

13 Meining A, Shah RJ, Slivka A, et al. Classification of probe-based confocal laser endomicroscopy findings in pancreaticobiliary strictures[J]. Endoscopy, 2012, 44 (3): 251-257.

14 Talreja JP, Sethi A, Jamidar PA, et al. Interpretation of probe-based confocal laser endomicroscopy of indeterminate biliary strictures: is there any interobserver agreement[J]? Dig Dis Sci, 2012, 57 (12): 3299-3302.

15 Kiesslich R, Burg J, Vieth M, et al. Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancerinvivo[J]. Gastroenterology, 2004, 127 (3): 706-713.

16 Buchner AM, Shahid MW, Heckman MG, et al. Comparison of probe-based confocal laser endomicroscopy with virtual chromoendoscopy for classification of colon polyps[J]. Gastroenterology, 2010, 138 (3): 834-842.

17 Shahid MW, Buchner AM, Heckman MG, et al. Diagnostic accuracy of probe-based confocal laser endomicroscopy and narrow band imaging for small colorectal polyps: a feasibility study[J]. Am J Gastroenterol, 2012, 107 (2): 231-239.

18 Shahid MW, Buchner AM, Coron E, et al. Diagnostic accuracy of probe-based confocal laser endomicroscopy in detecting residual colorectal neoplasia after EMR: a prospective study[J]. Gastrointest Endosc, 2012, 75 (3): 525-533.

19 De Palma GD, Staibano S, Siciliano S, et al.Invivocharacterisation of superficial colorectal neoplastic lesions with high-resolution probe-based confocal laser endomicroscopy in combination with video-mosaicing: a feasibility study to enhance routine endoscopy[J]. Dig Liver Dis, 2010, 42 (11): 791-797.

20 Gómez V, Buchner AM, Dekker E, et al. Interobserver agreement and accuracy among international experts with probe-based confocal laser endomicroscopy in predicting colorectal neoplasia[J]. Endoscopy, 2010, 42 (4): 286-291.

21 Mascolo M, Staibano S, Ilardi G, et al. Probe-based confocal laser endomicroscopy evaluation of colon preneoplastic lesions, with particular attention to the aberrant crypt foci, and comparative assessment with histological features obtained by conventional endoscopy[J]. Gastroenterol Res Pract, 2012, 2012: 645173.

22 Hurlstone DP, Thomson M, Brown S, et al. Confocal endomicroscopy in ulcerative colitis: differentiating dysplasia-associated lesional mass and adenoma-like mass[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2007, 5 (10): 1235-1241.

23 van den Broek FJ, van Es JA, van Eeden S, et al. Pilot study of probe-based confocal laser endomicroscopy during colonoscopic surveillance of patients with longstanding ulcerative colitis[J]. Endoscopy, 2011, 43 (2): 116-122.

24 Pittayanon R, Rerknimitr R, Wisedopas N, et al. Flexible spectral imaging color enhancement plus probe-based confocal laser endomicroscopy for gastric intestinal metaplasia detection[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28 (6): 1004-1009.

25 Nakai Y, Shinoura S, Ahluwalia A, et al. Molecular imaging of epidermal growth factor-receptor and survivininvivoin porcine esophageal and gastric mucosae using probe-based confocal laser-induced endomicroscopy: proof of concept[J]. J Physiol Pharmacol, 2012, 63 (3): 303-307.

26 Shahid MW, Buchner A, Gomez V, et al. Diagnostic accuracy of probe-based confocal laser endomicroscopy and narrow band imaging in detection of dysplasia in duodenal polyps[J]. J Clin Gastroenterol, 2012, 46 (5): 382-389.

27 Fuchs FS, Zirlik S, Hildner K, et al. Confocal laser endomicroscopy for diagnosing lung cancerinvivo[J]. Eur Respir J, 2013, 41 (6): 1401-1408.

28 Adams W, Wu K, Liu JJ, et al. Comparison of 2.6- and 1.4-mm imaging probes for confocal laser endomicroscopy of the urinary tract[J]. J Endourol, 2011, 25 (6): 917-921.