Foxp3+调节性T细胞与结直肠癌关系的研究进展

时丽平 孙秀威

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院门诊化疗科(150040)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前最常见的恶性肿瘤之一，大量证据表明CRC的发生、发展与机体免疫状态有关。恶性肿瘤是宿主体内一群能不断表达正常抗原(基因过度表达)和(或)异常抗原(基因修饰、突变或缺失)的自身组织细胞[1]。机体免疫系统可通过肿瘤免疫识别肿瘤，但并不一定能有效激发抗肿瘤免疫反应，说明肿瘤的发生既与基因调控异常有关，亦与机体抗肿瘤免疫反应失调存在一定的联系。自1995年Sakaguchi等[2]首次报道调节性T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)以来，其肿瘤免疫的作用备受学者关注。Treg细胞在肿瘤微环境中的表达可抑制识别了自身肿瘤细胞的免疫效应细胞的发育和活化，可能是导致肿瘤免疫逃逸的因素之一，避免肿瘤杀伤，从而促进肿瘤的生长。研究发现Foxp3(forkhead box P3)属于叉头转录因子家族成员之一，是调控Treg细胞发育和功能效应的关键因素，亦是Treg细胞较可靠的标记[3]。已有研究[4]显示，CRC患者肿瘤组织中Foxp3+Treg细胞数目显著高于癌旁未受肿瘤侵犯的黏膜层。本文就Foxp3+Treg细胞的主要特征、功能、可能的作用机制及其与CRC临床病理特征和预后的关系作一阐述。

一、Treg细胞概述

1. Treg细胞的主要特征：Treg细胞以表面高水平表达CD25、CD4、CD103、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)和神经纤毛蛋白-1(Nrp-1)，低水平表达细胞表面分子CD127[5]为主要特征。并非所有CD4+CD25+T细胞均为Treg细胞，仅CD25高水平表达的细胞才是Treg细胞，这类细胞应具备FOXP3表达或CD127-的特点。Foxp3是Treg细胞关键的细胞内标记，对Treg细胞的分化、发育和免疫调节功能的发挥具有重要作用[6]。人Foxp3基因定位于X染色体，是具有共同高度保守序列“叉状头/翅膀状螺旋” DNA结构域的转录因子forkhead/winged-helix家族成员之一，通过该结构域与DNA特定位点结合，调节目的基因的活化和表达。Foxp3除含有forkhead结构域外，其转录抑制部位位于N末端区域，其后还含有一个C2N2锌指结构和亮氨酸拉链。Foxp3的N末端转录抑制性区域是转录因子的特异性功能区域，或许对Treg细胞的生理功能发挥重要调节作用，目前Foxp3具体的调节机制尚不清楚。

2. Treg细胞的功能特性：Treg细胞具有两大功能特性，分别为免疫无能性和免疫抑制性。免疫无能性表现为Treg细胞对高密度白细胞介素(IL)-2单独刺激、固相包被或可溶性CD3单抗以及CD3和CD8单抗联合作用均无应答，且Treg细胞本身不分泌IL-2；免疫抑制性表现为活化的Treg细胞可经多种途径非特异性抑制T细胞的活化和增殖，即对CD4+和CD8+T细胞等均有抑制作用。

3. Treg细胞对肿瘤免疫抑制作用的机制：肿瘤患者中Treg细胞升高的具体机制目前尚不十分明确，是Treg细胞升高导致肿瘤的发生，抑或是肿瘤微环境使Treg细胞募集的问题，还有待进一步探索。

Treg细胞可通过分泌抑制性细胞因子和表面分子与目标细胞接触两种途径发挥抗肿瘤的免疫抑制效应。①Treg细胞可分泌转化生长因子(TGF)-β、IL-10、颗粒酶等细胞因子来发挥免疫抑制功能。TGF-β对机体多种免疫细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)、树突细胞、巨噬细胞等的生长、发育均有重要调节作用。有研究表明TGF-β能抑制淋巴细胞增殖，抑制巨噬细胞的活化[7-8]。IL-10是Treg细胞分泌的具有免疫抑制作用的细胞因子，Strauss等[9]对头颈鳞癌患者的研究发现，Treg细胞产生的IL-10能明显拮抗机体抗肿瘤的免疫反应。IL-10可明显降低抗原特异性T细胞增殖，还可使树突细胞表面CD40、CD80和CD86等共刺激分子表达下调，从而使树突细胞呈递的抗原利于Treg细胞的诱导活化，而不利于效应T细胞诱导。颗粒酶是一种丝氨酸蛋白酶，活化的Treg细胞可通过分泌颗粒酶A通过穿孔素途径引起T细胞、单核细胞和树突细胞凋亡。②Treg细胞表面的CTLA-4与目标细胞如T细胞、B细胞、树突细胞和巨噬细胞上的B7配体结合后可抑制目标细胞的活化增殖，并可通过B7/CTLA-4作用于抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC)，抑制效应T细胞的活性。诱导荷瘤小鼠体内Treg细胞的CTLA-4缺失，可诱发显著的抗肿瘤免疫效应，引起肿瘤消退[10]。此外，Treg细胞可通过CD25竞争性结合IL-2从而抑制效应T细胞和NK细胞的功能[11]。有研究发现，Treg细胞还可通过调节核因子κB受体激活因子的配体(receptor or activator of NF-κB ligand, RANKL)信号来促进肿瘤转移[12]。

二、Foxp3+Treg细胞与肿瘤免疫调节

1. 肿瘤微环境中Foxp3+Treg细胞的变化：Woo等[13]首次报道了Foxp3+Treg细胞在非小细胞肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞和卵巢癌相关淋巴细胞中的比例上调，并可分泌细胞因子TGF-β和IL-10，抑制T细胞的活化和增殖。随后的临床研究发现，在头颈癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃肠肿瘤、胰腺癌、前列腺癌等多种实体瘤患者中，外周血淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中均可见Treg细胞比例、数目增高。表明恶性肿瘤患者体内Foxp3+Treg细胞上调是一种普遍现象，可能对肿瘤的自身免疫发挥重要的调节功能。肿瘤患者外周血和肿瘤局部Treg细胞数量增加及其在淋巴细胞中比例上调的可能原因为肿瘤诱导Treg细胞增殖以及肿瘤诱导Treg细胞聚集。但Foxp3+Treg细胞在肿瘤局部的表达频率因肿瘤类型、疾病进展状态不同而有所不同[14]。Du等[15]的研究发现，在胃癌肿瘤微环境中人白细胞抗原-G可通过上调Treg细胞进行免疫逃逸，同时肿瘤细胞作为自身抗原在局部微环境中的持续刺激可诱导Treg细胞的生成。此外，肿瘤微环境可分泌多种趋化因子(如CCL22)，这些趋化因子与Treg细胞表面受体结合后可募集Treg细胞至肿瘤部位发挥免疫抑制作用[16]。

2. Foxp3+Treg细胞与肿瘤发生、发展的关系：Liyanage等[17]的研究表明Treg细胞对免疫效应细胞的抗肿瘤免疫反应有一定的抑制作用，去除Treg细胞后可提高活化效应细胞的免疫杀伤功能。Foxp3可能通过影响Treg细胞的发育来对其进行功能调节。但最近一项系统性研究[18]发现，Foxp3+Treg细胞与部分肿瘤如结直肠癌的良好预后相关。该研究对Foxp3+Treg细胞与肿瘤位置、肿瘤细胞的分子类型、肿瘤分期、分化程度等多种因素的关系进行综合分析，结果显示Treg细胞对肿瘤预后的影响可能不仅仅依赖于数量和功能，同时还依赖于其在淋巴细胞中的比例、特异性解剖学定位甚至是局部组织分布。有研究发现，通过定位模式而非检测Foxp3+Treg细胞数量可预测胃癌患者的生存期[19]；Foxp3+Treg细胞/粒酶B细胞比值可预测霍奇金淋巴瘤患者的预后[20]；Foxp3+Treg细胞对ER阳性的乳腺癌患者预后具有一定评估作用，而对ER阴性乳腺癌患者则不然[21]。上述研究结果说明在不同类型肿瘤的发生和发展中Treg细胞可能起不同的作用。Foxp3+Treg细胞与肿瘤预后关系的结果不一，可能还与研究所采用的技术、抗体、评分策略以及统计学方法的差异有关[18]。

三、Foxp3+Treg细胞与CRC发生、发展的关系

近年随着分子生物学技术的迅速发展、基因测序以及分子诊断水平的提高，不断发现新的CRC预后因子，Foxp3+Treg细胞是继K-ras后对CRC预后判断具有潜在意义的分子标记物之一，可能成为一项CRC的独立预后评估指标[22]。虽然目前已证实Foxp3+Treg细胞在CRC患者肿瘤组织和外周血中的表达均高于正常人，但Foxp3+Treg细胞表达与预后的关系仍有争议。

1. Foxp3+Treg细胞与CRC临床病理特征的关系：Ling等[23]的研究表明，晚期CRC患者外周血和肿瘤局部的Treg细胞数量均高于早期患者。盖晓东等[24]的研究通过免疫组化法检测CRC组织中Foxp3+Treg细胞的表达和分布，结果显示CRC患者肿瘤组织中Foxp3蛋白表达水平显著升高，与癌旁组织相比差异有统计学意义(P<0.001)；中低分化组Treg细胞数量明显高于高分化组(P<0.01)；淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)；无远处转移组明显高于有远处转移组(P<0.01)；Treg细胞数量与癌巢内CD4+/CD8+比值呈显著负相关。表明Treg细胞在CRC肿瘤免疫中扮演重要角色，可能影响了肿瘤的分化，促进了肿瘤进展。

2. Foxp3+Treg细胞与CRC预后的关系：Salama等[14]的研究对967例Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者进行检测，发现肿瘤组织中Foxp3+Treg细胞表达水平明显提高，但Foxp3+Treg细胞数量增加的患者生存期反而延长，这与其在已报道的多种实体瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌和胰腺癌中的作用相饽。此外，该研究首次报道了CRC患者癌旁正常组织Foxp3+Treg细胞数量升高预示预后差，与肿瘤组织中Foxp3+Treg细胞的作用相反。Sinicrope等[25]的研究显示Treg细胞比例升高与CRC患者较短的生存时间相关，提示Treg细胞比例对CRC的预后有重要作用，检测肿瘤微环境中Foxp3+Treg细胞可能对CRC患者的预后有指导作用。此外，Betts等[26]的研究显示，CRC患者具有较高的Treg细胞水平，同时伴随CD4+T细胞对肿瘤相关抗原的抑制作用减弱，抗肿瘤免疫作用的减弱导致术后患者在一年内复发，说明Treg细胞有助于CRC的进展。Katz等[27]对188例结直肠癌肝转移患者肿瘤浸润性T细胞与预后的关系进行研究，结果表明Foxp3/CD4和Foxp3/CD8比例升高是结直肠癌肝转移患者总体生存期(OS)明显缩短的独立预后因素。Suzuki等[28]的研究表明Foxp3+VEGFR2+Treg细胞是CRC患者无病生存期(disease free survival, DFS)和OS的独立预后因素，而Foxp3+Treg细胞和Foxp3+VEGFR2-Treg细胞与DFS和OS无关。Kim等[29]的最新研究首次报道了Foxp3在CRC肿瘤细胞而非肿瘤浸润的Treg细胞中的表达与CRC患者疾病进展有关。该研究应用基因和蛋白分析法检测了CRC患者Treg细胞和肿瘤细胞中Foxp3的表达，发现肿瘤细胞中Foxp3高表达者预后更差，而Treg细胞中Foxp3的表达差异对患者的预后无明显影响。Yoon等[30]提出Foxp3+Treg细胞密度在CRC肿瘤基质和肿瘤上皮细胞中相似，但其对预后的影响与CD8+T细胞密度有关，Foxp3+Treg细胞数量升高仅在低密度CD8+T细胞环境中预示较好的预后，而在高密度CD8+T细胞环境中无预测预后的价值，认为低细胞毒性的免疫微环境有利于Foxp3+Treg细胞发挥积极的预后价值。Frey等[31]的研究对142例CRC患者行错配修复(mismatch-repair, MMR)基因状态分析，结果发现肿瘤浸润性Foxp3+Treg细胞数量升高可改善无MMR基因缺陷的CRC患者预后。

四、展望

Treg细胞的研究使人类对于肿瘤免疫和免疫逃逸机制的认识进一步丰富，同时为以往多种肿瘤免疫治疗疗效不佳提出新的解释，为肿瘤免疫治疗方面的应用提供了新思路。多项研究证实，CRC组织中Foxp3+Treg细胞的表达明显高于正常组织，但Foxp3+Treg细胞与CRC患者预后的关系受多种因素的影响，包括Foxp3：CD4和Foxp3：CD8比例、MSI基因状态、肿瘤的位置、肿瘤细胞的分子类型、肿瘤的分期、分化程度等。因此，应更深入了解Treg细胞的特性，不断探索Treg细胞与肿瘤相互作用机制及其与肿瘤免疫微环境的关系，采取新技术对Treg细胞亚型进一步细化，从而为更好地检测、治疗肿瘤提供新思路，为肿瘤免疫治疗取得新的突破提供更可靠的理论依据。此外，Foxp3的表达和功能不能再被认为仅限于T细胞，在多种不同组织来源的癌细胞如CRC细胞中亦表达，可能在生物体内发挥更广泛的功能[29]。因此，抑制肿瘤相关性Treg 细胞中的Foxp3表达和功能，以达到抗肿瘤目的的治疗方法值得进一步综合研究。

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