健神利水颗粒对脑出血大鼠神经功能损害及神经元细胞凋亡的影响

陈 炜，黄树武，高玉广，何 青，何乾超，黄德庆，张元侃，刘 泰

(广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

脑出血急性期首发的病理改变主要为血肿和迅速发生的脑组织器质性损坏［1］，而继发的病理改变主要是继发的脑水肿、炎症反应及血脑屏障的破坏和细胞凋亡等［2］。然而，动物实验和临床研究均发现，中等量的脑出血本身并不引起颅内压的明显升高，血肿周围组织水肿和继发性神经元损伤是影响患者预后的主要原因之一。目前尚未有药物能够确切地被证实可以有效地提高脑出血患者的功能恢复［3］。因此研究和开发安全有效的治疗措施尤为重要且具深远意义。而中药复方以多成分、多环节、多层次、多靶点的药理学作用见长，成为脑出血研究的热点之一。我们前期的研究表明，健神利水方有较好的抗脑水肿作用［4］。本文研究了健神利水颗粒对实验性脑出血大鼠神经功能损害及神经元细胞凋亡的影响，为其临床应用提供更多的实验依据。

1 材料

1.1 仪器 脑立体定位仪(ST－4ND，成都仪器厂);5、100μL 微量注射器;电子分析天平(Ohaus，AR2140);单反数码照相机［Canon(中国)，型号:EOS550D］;石蜡切片机(Thermo Scientific公司，货号:A78100001);组织包埋机(Thermo Scientific公司，货号:A81000003);RSJ－1A生物组织染色机(天津天利航空机电有限公司);TP1020组织脱水机(徕卡显微系统中国公司);ZKPJ－1A型展烤片机(天津天利航空机电有限公司)。

1.2 试药 Tunel试剂盒(批号:11684817910，Roche公司);胶原酶Ⅶ(Lot#SL BG8830V，美国Sigma公司);PBS 缓冲液(pH 7.2 ～7.4)、0.01 mol·L－1枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0，博士德生物技术有限公司;DAB显色试剂盒(博士德生物技术有限公司);健神利水颗粒(广西中医药大学第一附属医院中心药房);组方(白术10g、泽泻 10g、猪苓 15 g、茯苓 15 g、桂枝 6 g、丹参15 g、三七3 g)系江阴天江药业有限公司分别制成颗粒，以上7味中药颗粒剂溶于50mL开水中，药物浓度为 1.48 g·mL－1。

1.3 实验动物 清洁级健康20～22月龄雄性Sprague－Dawley大鼠120只，购自广西医科大学实验动物中心(动物合格证号:SCXK桂2009－0002)。

2 方法

2.1 模型的复制 采用计算机产生随机序列。随机分出假手术组、模型组、中药组。模型组:大鼠术前4 h禁食，2 h禁水，经10%水合氯醛(3mL·kg－1)腹腔注射麻醉后，参照Rosenberg等［5］的方法，固定于立体定位仪上，使前囟和后囟在同一水平面上。于前囟后1mm，右侧3mm处钻一直径约1mm的小孔，使用立体定位仪上的微量注射器进针6mm，即为右侧尾状核的位置。在10min内注入胶原酶Ⅶ0.5 U，注入完毕后停针5min，缓慢退针。假手术组:建立方法基本同胶原酶脑出血模型，但以等量生理盐水代替胶原酶。中药组:于模型建立3 h后灌服健神利水颗粒药液，给药量参照《现代医学实验动物学》计算，往后每天给药1次，直至每个时间点被处死。其余各组灌予等剂量生理盐水。各组造模后分6 h、24 h、3 d、7 d 4 个观察点。

2.2 取材与处理 各组术后清醒大鼠按时间点以Gareia［6］评分法进行神经功能缺损评分后断头处死，剥离大脑组织，取出血侧脑组织一部分进行脑水含量的测定。另一部分置于4%甲醛溶液中固定保存，制作石蜡切片后用于苏木精－伊红(HE)染色。

2.3 神经功能缺损评分 各亚组大鼠分别与造模前前天及以后的每个时间点进行神经功能缺损评分。参照Gareia评分法进行神经功能缺损评分，如表1。

表1 Gareia评分法

2.4 脑组织含水量测定 不同组别、不同时间点麻醉大鼠，断头处死，迅速取出脑组织，用刀片以针尖为中心取厚度约4mm出血侧脑组织，立即称湿重。将组织放入烘干箱100烘烤24 h再称干重。按Elliot公式计算脑组织水含量:脑组织水含量(%)=(湿重－干重)/湿重×100%。

2.5 DNA断裂的原位末端标记法(Tunel)检测神经元凋亡 步骤:制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter－POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照(阴性细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而阳性细胞呈现染色质浓缩、边缘化，细胞核呈深棕色)。

2.6 统计学方法 使用SPSS 19.0进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(one－way ANOVA)，方差齐则行LSD(L)检验，方差不齐则取Tamhane's T2检验结果，P＜0.05具有统计学意义。

3 结果

3.1 神经功能缺损评分 脑出血大鼠清醒后，假手术组未出现明显神经功能缺损，模型组出现严重神经功能缺陷。模型组和中药组的神经功能缺损评分于3 d达到高峰，7 d逐渐下降。模型组各时间点神经功能缺损评分低于中药组，但6 h时间点两组差异无统计学意义(P＞0.05);24 h、3 d、7 d差异有统计学意义(P＜0.05)，说明健神利水颗粒能减轻脑出血大鼠的神经功能损害，结果见表2。

表2 各组大鼠脑出血后各时间点神经功能缺损评分情况(，n=10)

表2 各组大鼠脑出血后各时间点神经功能缺损评分情况(，n=10)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05

组别6 h 24 h 3 d 7 d假手术组 17.10 ±0.57 16.30 ±0.82 16.00 ±1.05 17.10 ±0.74胶原酶组 13.60 ±1.26* 8.30 ±0.82* 6.00 ±1.25* 9.30 ±1.50*中药组 14.00 ±0.82* 12.00 ±1.25＊▲ 1.70 ±0.95＊▲ 12.50 ±1.96＊

3.2 脑组织含水量测定 大鼠脑出血术后不同时间点血肿周围脑组织含水量的变化如表3所示。模型组各时间点的脑组织含水量与假手术组比较均有明显升高，差异具有显著性(P＜0.05);24 h后，中药组脑组织水含量明显低于模型组。说明大鼠脑出血术后均有不同程度的脑水肿。假手术组随着时间推移脑水含量未见明显变化，模型组与中药组的脑水含量6 h时间点比较无明显差异，差异无统计学意义(P＞0.05)，随着时间的推移脑水含量逐渐升高，24 h明显升高，3 d时达到最高峰，7天后逐渐下降。两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);说明健神利水颗粒能减轻脑出血大鼠的脑水含量。

表3 各组大鼠脑出血后各时间点脑水含量()(%，n=10)

表3 各组大鼠脑出血后各时间点脑水含量()(%，n=10)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，▽P＜0.05

组别6 h 24 h 3 d 7 d假手术组 76.30±1.06 77.80±1.81 78.20±1.55 76.40±1.17模型组 79.50±4.32* 85.30±1.70* 88.10±2.08* 84.20±1.40*中药组 79.00±2.45* 81.20±1.03*▽ 82.20±1.48*▽ 80.70±0.95*▽

3.3 HE染色光镜观察结果 各组大鼠脑组织HE染色结果:假手术组变化不明显，细胞核以及核膜清晰可见，未见明显组织肿胀细胞坏死以及胶质细胞增生等情况发生;模型组和中药组6 h可见血肿周围脑组织充血肿胀，细胞疏松，24 h可以见出血部位液化，细胞坏死，组织水肿加重，血管周围间隙增宽，以上表现在模型组3 d时间点时最明显，见图1，且伴有胶质细胞增生。随着时间延长，至7 d时出血灶周围组织水肿逐渐减轻，胶质细胞增生仍然存在，细胞坏死减轻。

图1 3 d时间点各组HE染色结果(×200)

3.4 神经元凋亡情况 各时间点随机视野观察中，假手术组见少量凋亡细胞，模型组和中药组各时间点阳性细胞数与假手术组比较有统计学差异(P＜0.05)，模型组和中药组随着脑出血时间的延长，凋亡数量均有不同程度的增加，以模型组增加比较明显，并于3 d时达到高峰，见表4、图2，7 d后逐渐减少。模型组与中药组6 h时间点细胞凋亡数量比较差异无统计学差异(P＞0.05);模型组与中药组24 h时间点以后比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表4 各组大鼠神经元凋亡情况(，n=10)

表4 各组大鼠神经元凋亡情况(，n=10)

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与模型组比较，▽P＜0.05

组别6 h 24 h 3 d 7 d假手术组 55.10 ±13.88 80.40 ±6.40 94.70 ±11.12 75.40 ±11.52模型组 80.60 ±11.54* 151.80 ±11.48* 212.60 ±16.68* 164.90 ±18.60*中药组 78.90 ±11.34* 93.80 ±12.27*▽119.90 ±10.41*▽ 96.80 ±19.17*▽

图2 3 d时间点各组细胞凋亡情况(×400)

4 讨论

脑组织出血后瘀血留滞脑络，致气化失调，使水液不行而渗于脉外，发为脑水肿。因此脑出血急性期脑水肿的中医关键病机是:“脑中蓄血”和“脑内蓄水”。为“瘀水”互结致脑失其司知觉、司运动之机能而猝然出现偏瘫、失语、偏麻、甚则昏迷的脑中风诸症。治疗宜“温阳化气，利水行瘀”。健神利水颗粒是以五苓散加三七、丹参制成。方中重用泽泻为君，以其甘淡，直达肾与膀胱，利水渗湿。臣以茯苓、猪苓之淡渗，增强利水渗湿之功。佐以白术和茯苓健脾以运化水湿。原方五苓散治膀胱蓄水之证，本方加止血之三七以通脉行瘀，止血不留瘀。配丹参养血活血，改善微循环，共奏温阳化气、利水行瘀之功。其所治与脑出血、脑水肿的关键病机密切相关，故对促进急性脑出血患者神经功能及早恢复和提高日常生活质量有显著疗效。前期动物实验研究［7，8］结果提示，本方对实验性兔脑出血急性期的脑系数和脑含水量有降低作用，并能提高Na+－K+－ATP酶活力，减轻细胞毒性，保护血脑屏障。有研究发现［9］，脑出血后的小胶质细胞的激活具有神经毒性作用，而适度的激活则具有一定的神经保护作用。本实验研究发现中药组神经功能缺损、脑水含量、神经元细胞凋亡、血肿周围的 小胶质细胞浸润比胶原酶组轻，提示健神利水颗粒可能通过抑制炎症反应而达到脑保护作用。

本研究发现，与中药组相比，24 h以后模型组出现严重神经功能损害，脑水含量明显升高，细胞浸润及神经元细胞凋亡明显增多。提示健神利水颗粒对脑出血具有较好的脑保护作用;本研究主要以组织形态学观察健神利水颗粒方对实验性脑出血大鼠的脑保护作用，尚缺乏对内源性神经干细胞的增殖分化及相关蛋白表达等研究。研究发现［10］脑出血可能与易患基因有关，这为今后研究脑出血的防治提供新的思路，因此今后应从免疫组化，免疫荧光技术，神经示踪技术等进行研究本方的有效性，为其在临床上的推广提供可靠的实验依据。

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