HPCE法测定小蓟中咖啡酸含量

刘学杰，陈晓健

(1.烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台 264000;2.烟台海港医院，山东 烟台 264000)

小蓟为多年生草本植物，俗称青刺蓟、刺儿菜，为菊科植物 Cirsium setosum(Willd)MB.的干燥地上部分，具有凉血、祛瘀、止血之功效，主要用于治疗吐血，衄血，尿血，血淋，便血，血崩等［1～3］。咖啡酸是小蓟具有止血疗效的有效成分之一，属有机酸，具有缩短血凝及出血时间的作用，并可代替凝血酶作血浆纤维蛋白质平板法纤溶实验［4～7］，它的含量将直接影响小蓟的止血功效。本文采用目前发展较快的高效毛细管电泳法(HPCE)测定小蓟中咖啡酸的含量，为控制小蓟质量提供科学依据。

1 仪器与试药

Beckman coulter高效毛细管电泳仪(PDA检测器);AB265－S分析天平(梅特勒－托利多公司);JAC－500型数控超声波清洗机(山东省济宁市奥波超声电气有限公司);Seven Multi pH计(梅特勒－托利多公司);咖啡酸对照品(批号:110885－200102，含量测定用，中国药品生物制品检定所);甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯;试验用小蓟采自山东省莱阳市，经烟台市食品药品检验检测中心姜慧祯主任中药师鉴定为菊科植物Cirsium setosum(Willd)MB.。

2 方法与结果

2.1 电泳条件 未涂层石英毛细管柱(75μm×50 cm，河北永年光导纤维厂);缓冲溶液为25mmol·L－1硼砂溶液;分离电压20 kV;柱温25℃;检测波长323 nm［8］。条件:0.1 mol·L－1NaOH 溶液，重蒸馏水。

2.2 对照品储备溶液的制备 精密称取咖啡酸12.10mg，置100mL具塞量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粗粉0.2g(干燥品)，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入5%甲酸的甲醇溶液25mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用5%甲酸的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液1mL置10mL量瓶中加5%甲酸的甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，即得［9，10］。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密量取咖啡酸对照品储备液(0.121mg·mL－1)1、2、4、6、8mL 至 10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得每1mL含咖啡酸12.1、24.2、48.4、72.6、96.8 μg，分别进样10μL，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程Y=246446X－174807，r=0.9990。结果表明，在此色谱条件下，咖啡酸在进样量为0.121～0.968 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验 取咖啡酸对照品溶液(24.2 μg·mL－1)，重复进样5次，以峰面积计算 RSD为1.12%，说明该方法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取小蓟药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8 h 测定咖啡酸峰面积，计算 RSD 值为0.9%，表明供试品液在8 h内基本稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批小蓟药材5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按上述相同色谱条件下进行测定，计算5份样品中咖啡酸含量，结果RSD值为1.38%，表明试验的重复性良好。

2.4.5 回收率试验 取已知咖啡酸含量的小蓟药材9份，每份约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入1.6628mg·mL－1咖啡酸溶液1.6、2.0、2.4mL，加入咖啡酸的量分别是2.6602、3.3252、3.9903mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按上述相同色谱条件下进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

本测定方法测得的咖啡酸的平均回收率为96.33%，符合含量测定的要求。

2.4.6 样品的含量测定 分别取3批小蓟药材各0.2g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定咖啡酸含量，结果见图1、表2。

图1 HPCE色谱图

表2 含量测定结果

3 结果与讨论

3.1 不同提取方法及溶剂的影响 咖啡酸的提取方法很多有冷浸法、加热回流法、超声法等，冷浸法不能将咖啡酸提取完全，加热回流法会在提取咖啡酸的同时结晶出大量黄酮类化合物［11］，故本文选择超声法提取。提取咖啡酸的溶剂也很多，如水、甲醇、乙醇等，考虑到溶液的导电性对试验的影响故选择5%甲酸的甲醇溶液。

3.2 不同缓冲液的影响 本文曾选择不同浓度的磷酸盐、硼砂缓冲溶液，结果发现25mmol·L－1的硼砂缓冲溶液分离效果最好，随着缓冲液浓度的增加，迁移时间变长，分离度变好，但缓冲液浓度过大时会由于产生热效应而影响分离，所以选择最佳缓冲溶液浓度为 25mmol·L－1。

3.3 电压的影响 本文考察了在 12、15、18、20、25、35 kV下在25mmol·L－1的硼砂缓冲溶液中运行试验，结果表明，电压对咖啡酸的分离非起决定作用，但是电压能影响咖啡酸的分离速度，电压的升高会增加离子的迁移速度，从而缩短分析时间，考虑到样品的分离度，试验中所采用的20 kV电压能使咖啡酸得到较好的分离效果。

HPCE相对于传统的高效液相色谱法(HPLC)灵敏度更高、分离效果更快，本试验中利用HPCE法检测小蓟中咖啡酸的含量，取得了较好的分离效果，且操作简单、精度高，可发展为检测咖啡酸的一种常用方法。

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