Carfilzomib:从天然产物到药物的研发历程

钮俊兴，徐星宇，胡立宏

(中国科学院上海药物研究所，中药现代化中心，上海201203)

Carfilzomib:从天然产物到药物的研发历程

钮俊兴，徐星宇，胡立宏

(中国科学院上海药物研究所，中药现代化中心，上海201203)

摘要:天然产物及其衍生物是药物的重要来源。Carfilzomib是一个以天然产物为先导通过结构优化得到的用于治疗多发性骨髓瘤的药物，其先导化合物Epoxomicin是从微生物中发现的具有抗癌活性的环氧酮肽类天然产物，能够选择性地抑制蛋白酶体，其环氧酮结构以独特的两步反应和蛋白酶体共价结合，因此克服了同类药物的脱靶缺点。以Epoxomicin为先导，通过结构优化得到活性更强、成药性性更好的Carfilzomib，作为新一代蛋白酶体抑制剂于2012年上市。

关键词:蛋白酶体抑制剂; Carfilzomib; Epoxomicin

1　简介

天然活性产物具有结构新颖，药理活性多样的特点，是新药创制的重要来源，临床上有约50%的药物直接或间接来源于天然产物，但大多数天然产物存在活性弱、特异性低、类药性差等缺点，因此需要根据其不足，有针对性的进行结构优化。本文通过总结文献，介绍以活性天然产物Epoxomicin为先导化合物，通过结构优化，得到上市药物Carfilzomib的实例，从药物化学的视角分析天然产物结构改造的要点。

Carfilzomib(商品名Kyprolis) (结构见图1)是美国Onys制药公司开发的新一代蛋白酶体抑制剂，于2012年7月20日获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，主要用于曾接受过两种或以上过往治疗方案(包括Bortezomib和免疫调节剂治疗)的多发性骨髓瘤患者。多发性骨髓瘤是恶性浆细胞在骨髓中克隆增生性疾病，也是一种较为罕见的致命疾病。作为一种罕见病用药，Carfilzomib是在美国FDA加速审批程序下获得批准的。

图1　Epoxomicin和Carfilzomib的结构图

2　Epoxomicin的发现及作用机制

2.1作用靶点蛋白酶体是真核生物细胞内降解蛋白质的核心部分，是一类桶装复合物，由1个20S核心颗粒和2个19S调节颗粒和许多多肽亚基组成。真核生物体中β1、β2、β5亚基具有水解蛋白的活性特点，其中β5亚基(糜蛋白酶样活性)负责大部分蛋白质的水解。蛋白酶体水解蛋白质时，首先产生具有活性的苏氨酸(Thr1)，在水传递电子的作用下，Thr1Oγ亲核进攻肽键的羰基，发生水解反应。

抑制蛋白酶体的水解活性会增加毒性蛋白、激活凋亡通路、导致细胞凋亡;在增殖活跃的肿瘤细胞中，由于异常蛋白的迅速积累致使蛋白酶体高表达，蛋白酶体的活性比正常细胞中更强。因而肿瘤细胞对抑制蛋白酶体活性导致的凋亡作用更敏感，因此，蛋白酶体被认为是治疗肿瘤的靶标。

2.2 Epoxomicin的发现来源于微生物的天然产物Epoxomicin(见图1)是一个具有环氧酮结构的天然线性多肽，于20世纪90年代，由百时美施贵宝(BMS)的东京研发部从编号Q996－17的放线菌菌株中首次分离得到［1］。尽管它在体内、体外均表现出很强的抗肿瘤活性(对鼠源黑色素瘤B16－F10和白血病P388细胞株增殖抑制的IC50均为2 ng·mL－1;对BDF1小鼠B16黑色素瘤静脉给药的有效剂量为每天0.13 mg·kg－1)，但BMS认为其有不稳定的环氧酮结构和较差的类药性质，加之抗肿瘤机制不明确，因此放弃了进一步的研究。

2.3 Epoxomicin的作用机制与此同时，耶鲁大学的Crews小组对Epoxomicin很感兴趣:一方面其体外体内抗癌活性很强;另一方面其环氧结构可能与蛋白通过共价键结合，易于获得靶蛋白，从而解释其抗癌的作用机制。Crews小组通过全合成得到了Epoxomicin，并利用生物素标记原理合成了分子探针［2，3］，通过探针确立靶蛋白为蛋白酶体β1、β2i和β5i亚基。合成的Epoxomicin能选择性地抑制蛋白酶体活性，不抑制其他蛋白酶如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等。

为了解释Epoxomicin高度选择性的原因，确定其与蛋白酶体结合的机理，Crews与慕尼黑理工大学的Groll合作得到了Epoxomicin和酵母菌蛋白酶体的晶体复合物［4］。通过晶体复合物发现Epoxomicin的羰基部分被蛋白酶体的Thr1Oγ进攻后形成半缩醛结构复合物，这个复合物分子中亲核性的Thr1N继而亲核进攻环氧，生成了6－exo－tet的吗啉环。这样的两步反应使Epoxomicin和蛋白酶体通过共价键不可逆地紧密结合在一起(见图2)。

图2　Epoxomicin和蛋白酶体的结合机制

当时在研的蛋白酶体抑制剂如醛肽类、烯砜肽类、硼酸肽类等，除了和蛋白酶体以共价键结合外，还与其他具有亲核性基团的蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶结合，有不同程度的脱靶作用，使得疗效较差，毒副作用较大［5］。而Epoxomicin这种通过两步反应形成共价键的机制，决定了它对具有独特Thr1结构的蛋白酶体有特异选择性，优于以往的蛋白酶体抑制剂，具有潜在成药性。

3　Epoxomicin的结构优化

因为Epoxomicin表现出了很强的蛋白酶体β5亚基的选择性抑制活性，所以Crews小组期望通过结构优化，得到蛋白酶体抑制活性和抗癌活性更强、成药性更好的候选药物。Epoxomicin的结构可分为两个部分(见图3) :环氧酮部分和四肽部分(四肽部分根据与蛋白酶体水解位点的距离分别为P1～P4)，下面分别对它们进行结构优化。

图3　多肽结构示意图

3.1环氧酮部分的改造由上文的作用机制可以看出，Epoxomicin的环氧结构是进行共价结合的活性必须基团。同时早期研究也表明，环氧结构为2R构型时有活性，而为2S构型时则活性降低或消失［6］，说明具有一定立体构型的环氧片段是保持活性所必需的，因而不对该部分进行改造。

3.2肽链的长度与活性的关系相关研究表明:蛋白酶体的20S催化亚基中的多个口袋，可以与多肽的侧链发生相互作用，而P1片段是该类4肽衍生物与蛋白酶体结合的关键位置［7］。当P1区域为亮氨酸或苯丙氨酸时，可以有效提高对β5亚基的选择性;而为碱性片段如赖氨酸和精氨酸时，β5亚基的选择性降低［8，9］。

因此，研发人员首先将R1～R4的取代基都改为异丁基，设计并合成化合物1～4，考察活性与链长的关系(见表1)。

表1　肽链长度与蛋白酶体不同亚基抑制活性关系

结果表明，肽链为四肽长度时，选择性和活性都最佳，肽链长度的缩短将导致活性和选择性的下降，推测可能与蛋白酶体催化位点口袋尺寸有关。

3.3 R2～R4取代基的优化在确定了四肽环氧酮为基本骨架后，研究人员以化合物1为基础，通过改变P2、P3、P4片段的氨基酸种类来探究其对活性的影响(见表2)。

表2　化合物5～15对蛋白酶体不同亚基抑制活性

续表2:

首先保持R3、R4都为异丁基，改变R2的取代基，得到化合物5～7。体外活性测试表明，R2基团为脂肪族取代基，活性较差;为芳香性取代基时，对酶的抑制效果以及选择性都有显著提高，尤其以苯乙基取代时，结果最优。

其次保持R2、R4取代基为异丁基不变，改变R3取代基，获得化合物8～10，发现将化合物1的R3取代基改为其他疏水性片段后，对酶抑制效果与选择性都降低了，所以R3取代基仍旧保持为异丁基。

随后再保持R2、R3取代基不变时，改变R4取代基的结构，获得化合物12～15，发现为芳香取代时，活性普遍较好，且以苯乙基取代时，选择性与活性最优。

基于以上结果，科研人员将R2、R3、R4的最优基团结合在一起，得到了化合物16(YU－101) (见图4)，以及其N－去乙酰基衍生物17。活性测试显示(见表3)，化合物17的活性、选择性均较弱; 16的活性、选择性更佳，其抑制蛋白酶体β5亚基的活性明显强于Epoxomicin和Bortezomib等蛋白酶体抑制剂，并且在体内具有强抗炎活性。

表3　化合物16、17对蛋白酶体不同亚基抑制活性

3.4候选化合物PR171的确定Crews将YU－101转让给了Proteolix制药公司(后被Onyx收购)， Proteolix继续进行改造得到了上百个化合物，但活性都不如YU－101。尽管YU－101抗肿瘤效果显著，但Proteolix公司很快发现YU－101的水溶性差，难以成药，因此引入吗啉环，合成了活性保持而水溶性增加几个数量级的化合物PR－171(见图4)，并以此作为候选化合物进入临床研究。

图4　Carfizomib的优化过程

4　Epoxomicin的上市

在Crews小组进行结构改造的同时，硼酸二肽类药物Bortezomib作为第一个蛋白酶体抑制剂成功上市，用于治疗多发性骨髓瘤。但临床研究发现Bortezomib不仅会出现血小板减少、周围神经炎等副作用，而且易产生耐药，分析可能是由于其脱靶作用造成的［10］。而环氧酮肽类化合物Carfilzomib因其特殊的共价结合方式对蛋白酶体的选择性高、结合力强，与Bortezomib相比能克服其脱靶作用，毒副反应较小。

对Carfilzomib的临床前研究［11，12］也证实其对蛋白酶体以及免疫蛋白酶体β5亚基的抑制活性与Bortezomib相当，并且对其他的蛋白酶都没有抑制活性;同时对Bortezomib耐药的病人也十分有效。因此，Carfilzomib作为第二代蛋白酶体抑制剂被FDA批准上市，用于此前至少经过两个优先疗法，包括Bortezomib和免疫调节剂治疗的多发性骨髓瘤患者。

5　总结

Carfilzomib从具有抗癌活性的天然产物Epoxomicin的发现，到其抑制蛋白酶体活性作用机制的阐明，再到通过结构改造发现活性更强化合物YU－101，最终到水溶性更好的Carfilzomib上市，这一研发历程对我们启示颇多。

5.1生物界的次生代谢产物是为了自身的生长和种群的繁衍而产生的，生来不是为了给人类治病，毒性、成药性等方面的缺陷决定了需要对它们进行结构改造。面对作用机制不明，类药性差等问题，应根据所研究的天然产物的性质，进行个性化、量体裁衣式地改造，有针对性地优化药效、药代、安全性等性质。

5.2明确作用机制有利于进一步的修饰改造。Epoxomicin独特的两步形成共价结合的机制的阐明，不仅明确了作用靶标为蛋白酶体，同时提示了环氧酮基团的必要性，为接下来的改造工作提供了便利。

5.3研发的新药必须要比上市或准上市药物更具有优势。在Epoxomicin的改造过程中，首个蛋白酶体抑制剂Bortezomib进入临床并批准上市，这对其他蛋白酶体抑制剂的开发也带来了更大的挑战和压力。但Bortezomib由于其可逆结合的机制，毒副作用较大且易耐药;而Epoxomicin作用机制独特:它选择性不可逆抑制蛋白酶体，以其为基础研发的第二代蛋白酶体抑制剂Carfilzomib克服了Bortezomib毒副作用大的缺点，同时对Bortezomib耐药的病人也有效果，故而得以在Bortezomib之后上市。

参考文献:

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［11］Arastu－Kapur S，Anderl JL，Kraus M，et al.Nonproteasomal targets of the proteasome inhibitors bortezomib and carfilzomib: a link to clinical adverse events［J］.Clin Cancer Res，2011，17(9) : 2734－2743.

［12］Demo SD，Kirk CJ，Aujay MA，et al.Antitumor activity of PR－171，a novel irreversible inhibitor of the proteasome ［J］.Cancer Res，2007，67(13) : 6383－6391.

·制剂研究·

·实验研究·

专家简介

胡立宏，男，中国科学院上海药物研究所研究员、研究组长、博士生导师，研究工作主要涉及“基于中草药资源的药物发现”研究领域。现任世界中医药学会联合会中药分析专业委员会理事、中国植物学会民族植物学分会理事、上海市药学会天然药化专业委员会委员、上海市口腔医学重点实验室学术委员会委员，以通讯作者身份在Journal of Neuroscience，Chemistry＆Biology，Journal of Medicinal Chemistry，Diabetes，Green Chemistry，Organic Letters等国际主流刊物上发表研究论文190余篇，获得发明专利授权10余项。2009年以“天然药物化学”研究方向获得“国家杰出青年基金”资助，并入选“中国科学院百人计划”，2012年获得了“上海市优秀学科带头人”称号。

Carfilzomib: from natural product to drug

NIU Jun-xing，XU Xing-yu，HU Li-hong
(Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China)

Abstract:Natural products and their derivatives have been invaluable as a source of therapeutic agents.Carfilzomib，a potential chemotherapy drug for patients with multiple myeloma，was developed from a microbial natural product Epoxomicin.Epoxomicin was found to exhibit potent anti－cancer activity，which might attribute to its inhibitory activity against proteasome.Because of its unique two －step binding mode，Epoxomicin has a clear advantage compared to other proteasome inhibitors with their substantial off－target activity.With a more pontecy and better drug－like properties，Carfilzomib was developed from the lead compound Epoxomicin and approved by FDA as a second－generation proteasome inhibitor in 2012.

Key words:Proteasome inhibitor; Carfilzomib; Epoxomicin

基金项目:国家自然科学基金面上项目(No.81473110)

中图分类号:R979.1

文献标识码:A

文章编号:2095－5375(2015) 10－0559－006