γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量测定方法的建立

刘凯双，沈 雁，涂家生

（中国药科大学药剂学教研室，江苏南京210009）

·实验研究·

γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量测定方法的建立

刘凯双，沈 雁，涂家生

（中国药科大学药剂学教研室，江苏南京210009）

目的建立γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量测定的方法。方法采用高效液相色谱法测定γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量，色谱柱为C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），流动相为含150 mmol·L－1氯化钠的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4），流速为0.65 mL·min－1，检测波长为210 nm。结果 顺铂质量浓度在4～200μg·mL－1范围内，其色谱峰面积与质量浓度的线性关系良好（r＝0.999 7）。顺铂含量测定的加样回收率平均值为99.78%，RSD小于2%。测得γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量约为26%～28%。结论 该法灵敏度高、专属性强、可用于γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂的含量测定。

γ－聚谷氨酸；顺铂；高效液相色谱法；含量测定

顺铂（Cisplatin，CDDP）是临床常用的广谱抗癌药物，但因其严重的肾毒性等副作用，限制了它的广泛使用［1］。此外，顺铂在体内很快和蛋白结合而失效，不能长时间维持有效的药物浓度，且铂半衰期长，体内毒性大，影响其疗效。我们应用可生物降解的γ－聚谷氨酸（γ－PGA）作为药物载体，通过接枝柠檬酸提高顺铂载药量，成功制备了一种半衰期长、毒性低、水溶性好、具有被动靶向和缓释效果的顺铂类似物γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物。

目前，文献报道顺铂制剂中顺铂含量的测定方法主要有电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）法［2］、高效液相色谱法、原子吸收光谱法［3］和衍生化－紫外分光光度法［4，5］。为了对水溶性顺铂复合物制剂进行质量控制，本文采用酸破坏的方法，将γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物酸降解，破坏载体游离出顺铂后，用HPLC进行顺铂含量测定。本法样品前处理简单，操作简便，结果准确可靠，可用于水溶性顺铂复合物中顺铂含量的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪（泵：LC－20A；检测器：SPD－20A）；LGJ－12真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；SHZ－28A型恒温水浴振荡器（太仓市华美生化仪器厂）；分析天平（伯拉莫贝林（上海）精密仪器有限公司）；pHS－3C型pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 试药 γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物（自制，批号：20131007－1、20131007－2）；顺铂（CDDP，山东铂源化工，批号：130601CI）；盐酸（南京化学试剂有限公司，批号：11121530695）；磷酸二氢钾（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20111208）；氯化钠（西陇化工股份有限公司，批号：131017）；氢氧化钠（西陇化工股份有限公司，批号：121006）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Hanbon Sci.＆Tech.Megres C18（4.6 mm×300 mm，5μm）；流动相：pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（含150 mmol·L－1NaCl）；流速：0.65 mL·min－1；检测波长：210 nm；柱温30℃；进样量：20μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液的制备 配制10 mg·mL－1的γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物储备液，取1 mL储备液加入2 mL 0.1 mol·L－1HCl溶液，于37℃恒温振荡箱中破坏12 h，取出后加入2 mL 0.1 mol·L－1NaOH溶液中和盐酸，用流动相定容至10 mL，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 配制400μg·mL－1的顺铂储备液，精密移取储备液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容得浓度为4、40、80、120、160、200μg·mL－1的溶液。

2.3 系统适应性试验 取6份“2.2.2”项下相同浓度的顺铂储备液，进样，记录色谱图。结果显示，按顺铂计算的理论塔板数大于3 000。

分别取顺铂溶液、供试品溶液、流动相，按“2.1”项下色谱条件，进样，记录色谱图（见图1）。

由图1可见，顺铂的保留时间约为5.660 min。流动相不干扰顺铂的测定，γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂酸破坏样品中降解产物与顺铂主峰的分离度为2.096，降解产物对顺铂测定无干扰。可见，该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 取顺铂20 mg，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为400μg·mL－1的顺铂储备液。分别精密量取顺铂储备液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，分置6个10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以进样浓度（μg·mL－1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y＝23 763X＋23 796（r＝0.999 7）。结果表明，顺铂在4～200μg·mL－1质量浓度范围内具有良好的线性关系。

图1 γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物含量测定方法的专属性考察

2.5 精密度 取“2.2.2”项下的顺铂储备液20 μL，进样，按“2.1”项下的色谱条件测定，连续进样6次，记录器色谱峰面积。结果显示，进样6次所得顺铂峰峰面积的RSD分别为0.20%，结果表明该方法重复性良好。

2.6 检测限与定量限 分别取“2.2.2”项下制备的顺铂储备液，加流动相配制成不同质量浓度的溶液，进样，记录色谱图。结果测得，信噪比（S／N）为3时，顺铂的检测限为0.02μg·mL－1；S／N为10时，顺铂的定量限为0.40μg·mL－1。

2.7 加样回收率 取γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物200 mg，置10 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作为复合物储备液。取2.5 mL储备液置25 mL棕色容量瓶中，加入7.5 mL 0.1 mol ·L－1HCl，于37℃恒温振荡器中振荡12 h，加入7.5 mL 0.1 mol·L－1NaOH中和酸，用流动相定容至刻度，作为酸破坏复合物储备液。分别精密量取酸破坏复合物储备液1.0 mL置9个10 mL容量瓶中，每3份一组，共3组。向各组样品中分别加入“2.2.2”项下制备的顺铂储备液2.0、2.5、3.0 mL，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，即得顺铂质量浓度分别为80、100、120μg·mL－1的供试品溶液，进样检测。结果显示（见表1），低、中、高3个质量浓度供试品溶液的顺铂平均加样回收率分别为98.67%、100.28%和100.40%，RSD分别为0.19%、0.26%和1.27%（n＝3），总平均回收率为99.78%，在98～102%范围内，RSD均小于2.0%，符合方法学要求。

表1 加样回收率试验结果（n＝3）

2.8 样品测定 取2个不同批次（批号分别为20131007－1、20131007－2）自制γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物，分别依法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，采用外标法计算γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量分别为26.18%和28.54%。

分别采用ICP－MS、原子吸收和紫外法测定20131007－1批次自制γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量，测定结果见表2。

γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物是以γ－聚谷氨酸－柠檬酸酯为载体，制备载药复合物。在酸性环境下，酯键与酰胺键发生降解反应，γ－聚谷氨酸－柠檬酸酯可被破坏，且在大量Cl－存在下，Cl－与γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中的羧基发生竞争交换反应，使顺铂从复合物中游离出来，从而测定顺铂含量。本方法适用于以化学键合方法载顺铂的前体药物中顺铂含量的测定，是顺铂制剂中顺铂含量测定的又一可行方法。

表2 ICP－MS、原子吸收和紫外法测定结果

3 讨论

笔者尝试用不同方法测定γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量，其中采用ICP－MS与原子吸收分光光度法测定时，样品前处理过程繁琐；衍生化－紫外分光光度法测定时，无法完全将水溶性复合物中顺铂衍生化，导致测定结果偏低；高效液相色谱直接测定时，由于顺铂与载体发生络合反应，无法直接测定γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂含量。采用酸破坏－HPLC法将复合物进行破坏后测定，既可在盐酸环境下使顺铂稳定，又建立了一种水溶性顺铂复合物制剂中顺铂含量的测定方法。该方法简便可行，重复性好，可用于测定水溶性γ－聚谷氨酸－柠檬酸－顺铂复合物中顺铂的含量，为顺铂前药中顺铂含量测定提供了新的方法，具有潜在的应用价值。

［1］汪明明，崔速南.抗癌新药顺铂的研究进展［J］.癌症，1986，5（1）：110－114.

［2］Xiao H1，Zhou D，Liu S，et al.A complex of cyclohexane－1，2－diaminoplatinum with an amphiphilic biodegradable polymer with pendant carboxyl groups［J］.Acta Biomaterialia，2012，8（5）：1859－1868.

［3］王亚敏，石庭森.石墨炉原子吸收法测定靶向制剂顺铂壳聚糖微球药物的含量［J］.药品检验，1995，30（10）：618－620.

［4］Masayuki Yokoyama，Teruo Okano，Yasuhisa Sakurai，et al.Introduction of cisplatin into polymeric micelle［J］.Journal of Controlled Release，1996，39（2－3）：351－356.

［5］田洁，逄秀娟，吴冬冬，等.顺铂固体脂质纳米粒的制备及其在大鼠体内的分布［J］.中国药剂学杂志，2008，6（4）：141－149.

Establishment of the content determ ination of cisplatin inγ－polyglutam ic acid－citric acid－cisp latin conjugate

LIU Kai-shuang，SHEN Yan，TU Jia-sheng
（Department of Pharmaceutics，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

ObjectiveTo establish amethod for determining the content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate.MethodsThe external standard method was used.The content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate was determined by acid destroy－HPLCmethod，in which C18column（4.6 mm×300 mm，5μm）was used，PBS（pH 7.4）was used as the mobile phase at a flow rate of 0.65 mL·min－1，and the detective wavelength was 210 nm.ResultsThe chromatographic peak area and concentration of cisplatin showed a good linear relationship at the range of 4～200μg·mL－1（r＝0.999 7）.The average recovery of cisplatin was99.78%，the RSD was less than 2%.The content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate was 26%～28%.ConclusionThe method was sensitive，specific，convenient and reliable.It can be used for the content determination of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate.

γ－polyglutamic；Cisplatin；HPLCmethod；Determination

R927.2

：A

2095－5375（2014）03－0129－003

国家自然科学基金资助项目（No.812001182）；中央高校基金培育项目（No.JKPZ2013006）

刘凯双，女，研究方向：药物新剂型与新技术，E－mail：kerain1109＠163.com

涂家生，男，教授，研究方向：药物新剂型与新技术，Tel：13605159819，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn