仙灵密骨颗粒质量标准的研究

刘群，邱少华，林晓

(1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101：2.临沂市检验检测中心，山东 临沂 276000)

本品是由续断、淫羊藿等味药材经合理的工艺提取得到的颗粒剂，具补肾益精、强筋健骨、活血通络之功效，用于骨质疏松症中证属“肾虚络瘀”者。其中淫羊藿，又名仙灵脾，能温肾壮阳、强筋骨、祛风湿，为方中君药[1]。现代药理研究亦表明，淫羊藿苷作为淫羊藿的主要有效成分，能显著促进成骨细胞增殖[2]。为了能科学有效地控制本品的内在质量，本研究选择淫羊藿苷作为高效液相色谱(HPLC)含量测定指标，同时对鸡血藤、淫羊藿、骨碎补、续断、千年健进行薄层色谱(TLC)鉴别研究，建立了仙灵密骨颗粒的定性定量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司，包括VWD检测器、Chemstation色谱工作站)；Mettler Toledo AG285电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ5200DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，160 W，40 kHz)；硅胶G薄层板(青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)。

1.2 试药 淫羊藿苷对照品(批号：0737-200011)、柚皮苷对照品(批号：722-200107)、川续断皂苷VI对照品(批号：111685-200401)、鸡血藤对照药材(批号：121173-200402)、千年健对照药材(批号：121571-201202)购自中国食品药品检定研究院。颗粒样品3批(批号：100104、100108和100112)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、三氯甲烷及其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 鸡血藤[3]取本品8 g，研细，加甲醇60 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加热水20 mL使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取不含鸡血藤的阴性制剂，同法制成鸡血藤阴性对照溶液。再取鸡血藤对照药材5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[《中国药典》2015年版(四部)通则0502]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。从图1中可以看出，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照液在与对照药材色谱相应的位置上无相同颜色的荧光斑点出现，表明阴性对照液对鸡血藤的鉴别无干扰，该法简便，快速，并具有良好的专属性。

1、4.鸡血藤对照药材溶液；2.阴性对照液；3.供试品溶液图1 鸡血藤的TLC鉴别色谱图

2.1.2 淫羊藿、骨碎补[3-4]取上述“2.1.1”项下三氯甲烷提取后的水液，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另分别取不含淫羊藿和不含骨碎补的阴性制剂，同法制成淫羊藿阴性对照溶液和骨碎补阴性对照溶液。再取淫羊藿苷对照品、柚皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[《中国药典》2015年版(四部)通则0502]试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置105 ℃烘箱中加热5 min，取出，置紫外光灯(365 nm)下检视。从薄层色谱图(见图2)上可以看出，供试品色谱中，在与淫羊藿苷和柚皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照液在与对照品色谱相应的位置上无相同颜色的荧光斑点出现，表明阴性对照液对淫羊藿苷和柚皮苷的鉴别无干扰，该法具有良好的专属性。

1.淫羊藿苷；2.缺淫羊藿阴性对照液；3.供试品溶液；4.缺骨碎补阴性对照液；5.柚皮苷图2 淫羊藿、骨碎补的TLC鉴别色谱图

2.1.3 续断[5-6]取“2.1.2”项下乙酸乙酯提取后的水液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次20 mL，弃去氨水层，正丁醇层再用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，加中性氧化铝(100～200目)1 g拌匀，挥干溶剂，加于中性氧化铝柱(100～200目，7 g，d=1.5 cm，干法装柱)上，用水30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取不含续断的阴性制剂，同法制成续断阴性对照溶液。再取川续断皂苷VI对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[《中国药典》2015年版(四部)通则0502]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一以0.5% NaOH溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。从薄层色谱图(见图3)上可以看出，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照液在与对照品色谱相应的位置上无相同颜色的斑点出现，表明阴性对照液对川续断皂苷VI的鉴别无干扰，该法简便，快速，并具有良好的专属性。

1、4.川续断皂苷VI对照品；2.阴性对照液；3.供试品溶液图3 续断的TLC鉴别色谱图

2.1.4 千年健[7]取本品8 g，研细，置250 mL圆底烧瓶中，加水100 mL，摇匀，上接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满其刻度部分，再于刻度管中加入乙酸乙酯4 mL，连接回流冷凝管，加热至沸，蒸馏1 h，分取乙酸乙酯层，作为供试品溶液。另取不含千年健的阴性制剂，同法制成千年健阴性对照溶液。再取千年健对照药材2 g,加乙醚20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[《中国药典》2015年版(四部)通则0502]试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。从薄层色谱图(见图4)上可以看出，供试品色谱中，在于千年健对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照液在与对照药材色谱相应的位置上无相同颜色的斑点出现，表明阴性对照液对千年健的鉴别无干扰，结果表明，该法简便、专属性强。

1、4.千年健对照药材；2.阴性对照液；3.供试品溶液图4 千年健的TLC鉴别色谱图

2.2 淫羊藿苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(30∶70)为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长270 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算不低于2 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含0.105 6 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水20 mL使溶解，滤过，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用50%的甲醇使溶解并转移至25 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例，取除淫羊藿以外的其他处方量药材，按处方制剂工艺同法制备缺淫羊藿的阴性对照样品，取阴性对照样品适量，按“2.2.3”项下同法制成阴性对照溶液。

2.2.5 系统适应性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样。结果表明阴性样品在淫羊藿苷出峰位置上无杂质峰，表明处方中其他药味对淫羊藿苷的含量测定无干扰(见图5)。

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照 1.淫羊藿苷图5 淫羊藿苷HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分别置于2 mL量瓶中，以50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，回归方程为Y=19.833×103X-6.223(r=0.999 9)，表明淫羊藿苷在进样浓度0.015 84～0.079 20 mg·mL-1范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.6”项下同一对照品溶液(浓度为0.047 52 mg·mL-1)，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果峰面积RSD为0.11%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、1、2、4、6、8 h按“2.2.1”项下色谱条件进样测定淫羊藿苷峰面积。结果峰面积RSD为0.69%，表明供试品溶液在8 h内测定是稳定的。

2.2.9 重复性试验 取同一批样品(批号：100108)6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果淫羊藿苷平均含量为1.260 mg·g-1，RSD为0.32%，表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取已知含量的同一批样品(批号：100108，淫羊藿苷含量为1.260 mg·g-1)6份，每份1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入淫羊藿苷对照品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果

2.2.11 样品测定 取上述3批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，每批平行测定2次，结果见表2。

表2 3批颗粒中淫羊藿苷含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层色谱条件的选择 在对处方中鸡血藤、淫羊藿、骨碎补、续断4味药材进行TLC定性鉴别时，根据上述药材所含化学成分的性质差异，在供试样品制备中，实现了以同一份样品的三氯甲烷部位用于鸡血藤鉴别，乙酸乙酯部位用于淫羊藿、骨碎补鉴别，正丁醇部位用于续断鉴别的实验操作，也可减少试剂对环境的污染。其中在鸡血藤供试品处理上，把样品的三氯甲烷提取液蒸干后，芒柄花素在热水中溶解较好，所以以热水溶解，滤过，可除去大量叶绿素等脂溶性杂质，减少了干扰，使斑点显色更为清晰；在其展开剂的选择上，参考《中国药典》[3]，并把三氯甲烷-甲醇比例由10∶1调整为20∶1，使得薄层斑点间分离度进一步得到改善。在续断供试品处理上，参考文献报道[5-6]，选择鉴别续断中的有效成分川续断皂苷VI，并通过甲醇回流提取，三氯甲烷、乙酸乙酯脱脂，正丁醇萃取，氨试液洗涤，中性氧化铝柱净化等操作，有效地消除了杂质成分干扰，使薄层色谱清晰可辨；同时，在本项试验中，曾尝试采用药典色谱条件，即以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂，采用硅胶G薄层板，结果却因供试品中川续断皂苷VI受其上方一黄色斑点干扰，使得对照品与供试品色谱行为不甚一致，且存在斑点拖尾现象，通过采用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂进行展开试验，仍无法解决，经摸索以 NaOH溶液制备的硅胶G薄层板展开，得到的结果较好，而以0.5%NaOH溶液制备的硅胶G薄层板得到的色谱为最好。在对处方中千年健药材进行TLC定性鉴别时，由于制剂中千年健挥发油采用倍他环糊精包合，其中挥发性成分采用乙醚直接提取效率较低，影响色谱结果判断；而通过挥发油提取器提取，样品成分提取效率得到提高，色谱斑点明显，对照药材用乙醚提取则可。

3.2 淫羊藿苷含量测定条件的确定 关于淫羊藿中淫羊藿苷的含量测定及提取文献报道[2,8]较多，供试品溶液的制备多选用乙醇或甲醇为提取溶剂，超声或回流提取，再以聚酰胺处理或以乙酸乙酯萃取，本文优选以甲醇为提取溶剂，超声提取30 min，再用乙酸乙酯萃取，既能保证制剂中的淫羊藿苷被提取完全，也尽可能地减少杂质对淫羊藿苷测定的干扰。采用《中国药典》2015年版(一部)淫羊藿含量测定项下的乙腈-水(30∶70)为流动相，以270 nm为检测波长，即可满足淫羊藿苷的分离[9]。经过试验验证，本文所建立的方法能较好地应用于颗粒的质量控制。