痹痛合剂对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织的影响

董莉莉，吴素玲，马春华，隆红艳，沙明慧

(南京中医药大学实验动物中心，江苏 南京 210000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其主要特征为慢性滑膜炎症,对称性多关节慢性炎症是其主要表现[1]。RA的发病机制目前来说基本达成了共识：RA患者可以诱导T、B细胞活化、局部浸润，产生多种炎性介质、细胞因子，引起关节滑膜炎症，出现慢性炎症症状。慢性炎症反应在RA的发展中起重要作用，其中，核因子-κB (NF-κB)的活化可以促进多种促炎症基因转录[2],包括:肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-2等等，导致RA炎症反应及结构破坏。

类风湿关节炎属于中医“尪痹”范畴，其致病因素为风寒湿邪，风、寒、湿相互交结成为本病的病理关键，“尪痹”多从风寒湿论治。痹痛合剂(苏药制字Z04000864)是江苏省南京市中医院的院内制剂。综观全方,组方精当,可使风湿除、肝肾强、筋骨壮而痹痛愈。临床观察验证了本方可有效地改善关节炎患者关节疼痛和活动受限的临床表现[4],是治疗类风湿关节炎症的有效方药。且以往研究显示，痹痛合剂能够延缓关节炎大鼠关节软骨的退变，提高关节软骨细胞中Bc1-2基因的表达[5]，抑制炎症因子IL-1的表达[6]。本课题组通过佐剂性关节炎大鼠模型，观察不同浓度的痹痛合剂对佐剂性关节炎大鼠血清中相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响，探讨痹痛合剂对于类风湿关节炎的作用机制和靶点，为痹痛合剂治疗类风湿关节炎提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠40只，体重：200～220 g，由南京市中医药大学实验动物中心提供，许可证编号：SYXK(苏)2014-0001。所有动物于室温(22±1)℃，空气湿度40%～50%，昼夜交替时间12 h条件下普通饲料喂养，自由饮水。适应性喂养1周。动物饲养按照国家实验动物管理条例进行。

1.2 药物与试剂 痹痛合剂(苏药制字Z04000864，每瓶250 mL，南京市中医院)；双氯芬酸钠片(中国药科大学制药有限公司，国药准字H10960217，每片50 mg)；弗式完全佐剂(南京纳晟生物科技有限公司，批号:ex210804)；蒸馏水(实验室自制)；生理盐水(哈尔滨三联药业股份有限公司，批号：150920D02)；苏木精水溶液、二甲苯、伊红乙醇染色液。大鼠IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(批号：E-EL-R0012c)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒(批号：E-EL-R0019c)、大鼠白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒(批号：E-EL-R0015c)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 仪器 全波长酶标仪(Bio-Tek Epoch)；荧光显微镜(奥林巴斯 BX43)；垂直电泳系统(Bio-Rad Mini Protean Tetra)；转膜印迹系统(Bio-Rad Mini Trans-Blot)；低温冰箱(海尔 DW-25L262)；台式离心机(美国贝尔曼)；超纯水系统(美国Thermo LabTower)；全自动高压灭菌锅(日本 Tomy SX-500)；微量分析天平(瑞士梅特勒 IKA T10)。

2 方法

2.1 动物分组 40只SD大鼠随机分成5组:空白组、模型组、双氯芬酸钠组、痹痛合剂高剂量组、痹痛合剂低剂量组，每组8只。

2.2 模型制备 0.2 mL弗氏完全佐剂皮内注射大鼠右后足趾，经过变态反应后形成佐剂性关节炎大鼠模型，正常组注射等体积的生理盐水在相同部位注射。

2.3 给药方法 造模成功后，计算给药剂量，痹痛合剂成人剂量为869 mg·kg-1，双氯芬酸钠成人剂量为1.66 mg·kg-1，以“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”为标准，痹痛合剂大鼠剂量为536 mg·(100 g)-1，双氯芬酸钠组每天剂量为0.5 mg·(100 g)-1，故痹痛合剂高剂量组每天剂量为536 mg·(100 g)-1痹痛合剂低剂量组每天剂量为268 mg·(100 g)-1痹痛合剂，空白组、模型组给予等体积蒸馏水。每组大鼠根据设定剂量连续灌胃给药21 d。给药21 d后，腹腔注射麻醉药剂，颈动脉放血处死大鼠。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 关节滑膜组织苏木素-伊红染液染色(HE染色) 于大鼠的右后肢正中纵行切开皮肤，分离肌肉露出膝盖骨，继续向下分离便能看见滑膜组织，手术刀分离关节囊的滑膜层、纤维层，取出滑膜层组织。取右后肢关节滑膜组织固定，在甲醛中过夜，固定包埋于石蜡后切成 4 mm 厚的切片。用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，HE染色；盖玻片覆盖在载玻片上封片，置于光学显微镜下观察并记录病变。

2.4.2 ELISA试剂盒检测大鼠滑膜组织中的炎症因子的含量 取大鼠关节滑膜组织，加入一定量磷酸盐缓冲液，3 500 rpm离心15 min，取其上清。检测关节滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.4.3 Western blot分析 采用Western blot检测大鼠NF-κB信号通路相关蛋白IKBa(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、P65(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、和 P-P65(1∶1 000)表达。关节滑膜组织总蛋白用RIPA裂解液进行提取，12 000 rpm条件下离心15 min，收集上清。采用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中直至样品到达分离胶的底部，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜完毕后，将条带浸入5%脱脂牛奶中封闭2 h。封闭结束后将PVDF膜分别浸入一抗中于4 ℃ 孵育过夜。第2天弃一抗加入第二抗体于摇床室温孵育2 h。二抗孵育结束后，弃抗体，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用凝胶成像系统进行曝光并用凝胶扫描成像系统扫描条带分析各条带灰度值。

3 结果

3.1 大鼠关节滑膜组织病理学改变 空白组：软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐，且四层结构清晰可辨，潮线完整，软骨基质染色为粉红色，着色均匀，未见炎性细胞浸润及血管增生现象；模型组：关节软骨破坏最为严重，软骨表面粗糙糜烂不整，形成缺损区，可见大量的炎性细胞浸润；阳性药组：细胞四层结构基本清晰，潮线基本完整；痹痛合剂低剂量组：细胞四层结构基本清晰，有少许软骨细胞存在轻度变性；痹痛合剂高剂量组：潮线可见基本完整，关节软骨存在少许炎性细胞浸润，关节软骨细胞具有轻度变性，表面仍有粗糙现象，结果见图1。

A.空白组;B.模型组;C.阳性药组;D.痹痛合剂低剂量组;E.痹痛合剂高剂量组图1 大鼠关节滑膜组织病理

3.2 大鼠关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平 与空白组相比，模型组大鼠关节滑膜组织中IL-1β、 IL-6 和 TNF-α等炎性细胞因子含量显著增加。与模型组相比，阳性药组、痹痛合剂低剂量组、痹痛合剂高剂量组关节滑膜组织中IL-1β、IL-6 和 TNF-α等炎性细胞因子含量显著降低(P<0.05)。表明痹痛合剂可以通过减少炎症因子的表达缓解大鼠关节滑膜炎症的症状，结果见表1。

表1 佐剂性关节炎大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平(pg·mL-1,n=8)

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与阳性药组比较，☆P<0.05；与合剂低剂量组比较，▲P<0.05

3.3 采用Western blot检测痹痛合剂对NF-κB信号通路相关蛋白的改善作用。如图2～3所示，与空白对照组相比，模型组大鼠IKBa、MyD88、P65、TLR4、p-IκBα和 P-P65的表达上调，在痹痛合剂低剂量组和痹痛合剂高剂量组治疗后，这些蛋白的表达显著下调，结果表明，痹痛合剂是通过NF-κB信号通路体现其对关节炎大鼠的治疗作用。

A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.痹痛合剂低剂量组；E.痹痛合剂高剂量组图2 痹痛合剂对关节炎大鼠关节滑膜组织NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

4 讨论

类风湿关节炎病变主要累及滑膜组织，主要病理特点是滑膜细胞增生，炎性细胞浸润。研究发现，多种炎性细胞因子如 IL-1β、干扰素(IFN) -γ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17等参与了RA的病理过程，此类细胞因子是导致软骨和骨损伤，介导RA发生及发展的重要因素。因此，抑制、阻断这类细胞因子及其受体是研究治疗RA药物的一个方向[7-8]。

痹痛合剂是经过我院研究开发的院内制剂。本方以牛膝、狗脊为君,治以强筋骨、补肝肾,怀牛膝是为引经药;防风、独活祛除风寒湿邪;徐长卿、威灵仙舒筋通络;鸡血藤、土鳖虫、桂枝活血通络,通达四肢关节;川草乌(制)散寒止痛;白术(炒)、茯苓健脾利湿;虎杖清热活血解毒,同时防诸药辛燥太过。临床观察验证，本方可有效地改善患者关节疼痛和活动受限的临床表现,是治疗RA的有效方药[4]。

本课题观察了痹痛合剂对RA大鼠滑膜组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-кB表达的影响，观察发现造模后，RA大鼠滑膜组织中 IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表达量均比正常组明显增高。痹痛合剂高低剂量组和双氯芬酸钠组中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表达量均有所降低，且痹痛合剂高剂量组较双氯芬酸钠组在降低 IL-6，NF-кB表达方面更为显著。实验的结果说明痹痛合剂可通过降低RA大鼠关节滑膜组织炎症因子的表达，来有效减轻RA大鼠滑膜组织的炎症反应。

C.空白组；M.模型组；Y.阳性药组；D.痹痛合剂低剂量组；G.痹痛合剂高剂量组图3 佐剂性关节炎大鼠血清中P-NF-кBP65/NF-кBP65、P-IkBa/IKBa、TLR4/GAPDH、MyD88/GAPDH的表达 注：与空白组比较，*P<0.05;与空白组和治疗组比较，**P<0.05；与空白组比较，##P<0.05，治疗组之间比较无统计学差异