马齿苋对去卵巢小鼠骨代谢生化指标的影响

李赛玉,曲扬,万芙,张颖

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

马齿苋(PortulacaoleraceaL.) 为马齿苋科马齿苋属一年生草本植物，资源丰富，在我国各地均有分布。现代药理学研究表明马齿苋具有抗菌、抗衰老、抗炎、抗氧化等多种药理作用[1]。马齿苋既可药用，又可食用，是我国卫健委划定的药食同源的野生植物之一。

随着中国人口老龄化，老年人常见疾病骨质疏松症(osteoporosis，OP)引起广泛关注，中国60岁以上人群骨质疏松总体患病率为36%[2]。OP是一种全身代谢性疾病，主要特征骨量减少，骨组织显微结构退化，可导致骨脆性增加及骨折危险性增加。雌激素与骨骼代谢密切相关，绝经后妇女卵巢功能衰退，体内雌激素水平低落，骨吸收与形成不平衡呈脱耦联状态，即骨质吸收增加、骨质形成减少，导致骨质疏松[3]。目前市面上的抗骨质疏松药物虽然具有确切的预防或者治疗骨质疏松的作用，但是长期服用经济成本较高，而且可能产生副作用[4-5]。因此，迫切需要寻找安全、有效、价格合理的防治OP的药物，更好地克服现有药物存在的问题。

近期有研究证实氧化应激[6-8]是绝经后骨质疏松症的重要发病机制，妇女绝经后受衰老和雌激素不足等因素的共同影响，体内氧化应激水平增高，使骨重建失衡，导致骨质疏松发病。有研究表明马齿苋醇浸出物对脂多糖(LPS)诱导的骨丢失起到保护作用[1]。马齿苋中总黄酮[9-11]及总多糖[12-14]具有抗氧化及清除自由基的作用。本实验采用卵巢切除手术(OVX)模型，研究马齿苋对去卵巢小鼠骨代谢的影响及其可能的机制，为马齿苋防治骨丢失的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物及饲养环境 昆明小鼠，8周龄，26～30 g，雌性，SPF级，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证编号：SCXK(辽)2015-0001。饲养环境：室温(22±1)℃，相对湿度为30%～65% RH，光照为150～200 Lx，每12 h明暗交替。

1.2 药品与试剂 马齿苋(东营百佳益中药饮片有限公司，批号：151204，产地安徽)；α-硫辛酸(LA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：C1604033)；葡萄糖(天津市大茂化学试剂厂，生产许可证号：XK13-201-00110)；芦丁(成都普菲德生物技术有限公司，批号：150108)；其余试剂均为分析纯；碱性磷酸酶(ALP，批号：20171120)、血清钙(Ca，批号：20171120)、磷(P，批号：20171120)、总胆固醇(TCHO，批号：20171120)、丙二醛(MDA，批号：20180110)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：20180105)、总蛋白(TP，批号：20180110)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 智能高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司，型号：3H16RI)；酶标仪(上海科华实验系统有限公司，型号：ST-360)；恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司，型号：KYC 1102 Incubator Shaker)；石蜡切片机(北京中西远大科技有限公司，型号：CN61M/LS-2055)；生物显微镜(日本Olympus公司，型号：BX51)。

2 方法

2.1 马齿苋水提物(water extract ofPortulacaoleraceaL.，WEPO)的制备 按药液比1∶40超声提取，提取功率100 W，提取时间30 min。提取完成后，将马齿苋水提液分别浓缩为0.2 g·mL-1(低剂量)与2 g·mL-1(高剂量)(折合成生药材的浓度)，备用。

2.2 WEPO中总黄酮和总多糖的含量测定

2.2.1 WEPO中总黄酮的含量测定 以芦丁作为对照，采用硝酸铝显色、紫外-可见分光光度法测定总黄酮的含量。分别将芦丁的浓度和显色后的吸光度作为横轴和纵轴，得到标准曲线Y=6.412 5X-0.039 4(r=0.999 5)。将WEPO以该法测定，得到其黄酮含量分别为0.29 g·L-1和2.9 g·L-1，折合成生药材含量为1.45 mg·g-1。

2.2.2 WEPO中总多糖的含量测定 以葡萄糖作为对照，采用苯酚-硫酸法测定总多糖的含量。分别将葡萄糖的浓度和显色后的吸光度作为横轴和纵轴，得到标准曲线Y=26.15X+0.000 8(r=0.999 9)。WEPO经Savage法除蛋白后以该法测定，得到其多糖含量分别为0.262 g·L-1和2.62 g·L-1，折合成生药材含量为1.31 mg·g-1。

2.3 实验动物分组及处理 小鼠适应性饲养1周后，按体重随机选出10只小鼠假手术(SHAM)和其余40只接受卵巢切除手术(OVX)。OVX小鼠20%乌拉坦[0.13 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉，无菌条件下经腰背部双侧切口，找到子宫，完整切除双侧卵巢，切口缝合。术后连续3 d灌胃罗红霉素0.003 9 mg·kg-1，防止伤口感染。术后恢复5 d后进行治疗。将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为SHAM组(生理盐水)、模型(OVX)组(生理盐水)、阳性药组(LA，0.078 g·kg-1)、WEPO低剂量组(生药2 g·kg-1)、WEPO高剂量组(生药20 g·kg-1)，各给药组灌胃给予相应剂量的药物溶液，0.1 mL·kg-1，每天1次，连续7周。期间每隔2 d称重1次并记录。7周后小鼠摘眼球采血，3 000 rpm离心10 min，分离血清；随后脱臼处死，摘除胸腺、子宫与脾称重并记录；取肝脏用生理盐水按1∶9制成10%肝匀浆，3 000 rpm离心10 min，取上层清液。将待测生物样本于-80 ℃保存待测。取两侧股骨，其中一侧股骨放于10%福尔马林固定，另一侧股骨称重并用游标卡尺测量长度。

2.4 指标检测

2.4.1 生化指标及抗氧化指标的测定 血清ALP、Ca、P、TCHO，肝匀浆MDA、SOD、TP按试剂盒说明测定。

2.4.2 骨组织学分析 骨组织经脱钙、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、脱蜡、染色、透明、封固后，光学显微镜观察。

3 结果

3.1 WEPO对小鼠体重增长率的影响 实验7周，OVX组小鼠体重增长率显著高于SHAM组小鼠(P<0.05)。与OVX组比较，WEPO高剂量组的小鼠体重增长率显著降低(P<0.05)，WEPO低剂量组、LA组小鼠与OVX组相比体重增长率有所降低，但无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。

表1 小鼠体重增长率

注：与SHAM组相比，#P<0.05；与OVX组相比，*P<0.05

3.2 WEPO对OVX小鼠子宫、脾、胸腺指数及骨重和骨长的影响 与OVX组比较，WEPO低剂量组和高剂量组小鼠子宫的重量显著增加(P<0.001)、骨长显著增加(P<0.05)；与OVX组相比，WEPO高剂量组小鼠胸腺指数显著降低(P<0.001)；WEPO能够改善OVX小鼠的骨重，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表2。

表2 小鼠子宫、胸腺、脾脏指数及骨重与骨长

注：与SHAM组相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3.3 WEPO对血清生化指标的影响 表3为WEPO治疗7周后不同组动物血清生化指标的结果。与SHAM组相比，OVX组小鼠ALP显著升高，用WEPO治疗后ALP均降低，WEPO高剂量组显著降低(P<0.05)。与SHAM组相比，OVX组血清Ca水平显著升高(P<0.05)，用WEPO治疗后Ca水平略有降低，低剂量组的差异有统计学意义(P<0.05)。与SHAM组相比，OVX组血清P水平升高，与OVX组相比，用WEPO治疗后血清P水平降低，低剂量组有显著性差异(P<0.01)。与SHAM组相比，OVX组小鼠血清TCHO水平显著升高(P<0.05)，与OVX组相比，用WEPO治疗后血清TCHO水平呈下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3.4 WEPO对抗氧化指标的影响 与SHAM组相比，OVX组肝组织中SOD水平显著降低(P<0.01)，用LA或WEPO治疗后小鼠肝组织中SOD水平均增加，且WEPO低剂量组与OVX组相比有显著性差异(P<0.01)。OVX组MDA含量较SHAM组低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与OVX组相比，WEPO治疗后MDA水平均降低，且WEPO高剂量组与OVX组相比有显著性差异(P<0.01)，结果见表4。

3.5 WEPO对骨微结构的影响 与SHAM组相比OVX可见透明软骨膜表面损坏、不光滑，软骨细胞排列紊乱、有的部位可见大量浸润的炎性细胞；与OVX组相比，在WEPO治疗后可见透明软骨膜修复较好，表面较光滑，软骨细胞排列基本整齐，可见部分炎性细胞。

表3 血清ALP、Ca、P与TCHO水平的变化

注：与SHAM组相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表4 肝匀浆SOD、MDA含量

注：与SHAM组相比，##P<0.01；与OVX组相比，**P<0.01

图1 骨微结构的变化[苏木精-伊红(HE)染色，×20]

3 讨论

卵巢功能退化，体内雌激素水平下降，雌激素缺乏是绝经后骨组织损伤及骨质疏松主要诱因，多表现为骨量下降、骨脆性增加、骨代谢指标的变化[15]。雌性小鼠的卵巢被切除以后，能够较准确地模拟妇女绝经后高转换型骨质疏松的骨丢失状态以及对各种干预因素的反应[16]。本实验采用去卵巢雌性小鼠模型，能够准确反映马齿苋提取液对雌激素缺失状态下改善骨代谢的作用。

小鼠去卵巢后，由于雌激素缺乏直接影响子宫的重量，子宫萎缩及体重(BW)增加被用作OVX成功的证据[17]。在本研究中，OVX小鼠显示BW增加和子宫重量减少，证实手术成功。在WEPO治疗后，BW降低，WEPO却能维持正常子宫重量，提示WEPO能拮抗去势造成的子宫质量减轻[18]。OVX也诱导胸腺T和B细胞的增加，导致胸腺和脾脏重量增加，进而导致更多的骨丢失[19]。本次实验发现用WEPO治疗的OVX小鼠胸腺重量减少。另一项研究报道，OVX小鼠的骨量和长度低于假手术小鼠[20]。在本研究中也证实了WEPO能够改善OVX小鼠骨骼的重量和长度。

骨是人体中钙、磷的最大储库，通过成骨与溶骨作用不断与细胞外液进行钙磷交换，以维持血钙与血磷的平衡[21-23]。骨转换标记已被广泛用作测量药物对骨重塑的影响的工具[24]。 OVX小鼠的骨转换增加[25]。本实验中，小鼠去卵巢后，血清钙磷水平增加，用WEPO 治疗后有所降低，可提示WEPO可抑制骨吸收，降低骨质疏松小鼠骨转换率。ALP是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸酯的无机磷促进基质矿化，骨形成与ALP的活性高度相关，ALP是反映成骨细胞的重要标志[21-23]。实验中OVX组小鼠血清ALP活性显著升高，提示去卵巢小鼠骨代谢呈高转换状态，一般认为这种血清碱性磷酸酶活性的升高是伴随着骨吸收亢进而出现的代偿性骨形成增强引起的[16]。雌激素可以调节胆固醇的代谢和沉积，卵巢切除后，雌激素水平下降，脂质代谢紊乱，血浆总胆固醇升高[26-27]。用WEPO治疗7周后降低了血清Ca、P和ALP水平，提示WEPO可以降低OVX诱导的高骨转换率。

研究表明，雌激素水平下降，体内活性氧增加，可能是引起绝经后骨质疏松症的重要原因之一[28]。马齿苋总黄酮对氧自由基和羟基自由基都有良好的清除能力[9-11]，另外有研究表明马齿苋总多糖具有显著的体外抗氧化活性[12-14]。MDA是氧自由基引起脂质过氧化的终末代谢产物，其含量反映了脂质过氧化程度并间接反映氧自由基含量。在生理情况下，自由基的产生和清除过程维持着动态平衡。如果自由基产生过多或清除不足，细胞就会受到损伤甚至死亡[26]。SOD主要由肝细胞产生，存在于肝细胞胞浆和线粒体，是重要的超氧阴离子清除剂，可减缓、抵御自由基损害，保护细胞。本次实验发现WEPO可以有效调节OVX小鼠肝脏中MDA及SOD水平的变化， WEPO可能改善去卵巢小鼠的氧化应激状态，进而调节骨代谢的动态平衡。

综上所述，WEPO能够改善骨代谢水平及机体的氧化应激水平，其效果与阳性药组相似，这些证据可提示马齿苋可能是通过改善氧化应激来改善骨代谢的。在所测定的指标中BW、ALP和MDA等指标呈剂量相关性，而血清Ca、P和SOD等指标中则是低剂量组优于高剂量组，其原因可能是由于给药剂量的不同，药物吸收程度不同，或者是由于药物浓度不同，药物成分间的相互影响程度不同[29]。马齿苋来源广，毒副作用小，价格便宜，具有广阔的开发前景，但是其成分复杂，其作用机制可能与多种因素有关，确切的作用机制还需要进一步研究。