盐酸赛庚啶在Caco-2细胞中吸收转运的研究

金永华，刘健，刘卉芳，李文娟，童焕，王湛博，杨勇，吴玉林

(1．中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏南京211198;2．中国药科大学新药安全评价研究中心，江苏南京211198)

体内生物等效(bioequivalence，BE)是证明仿制药和原研药等效的“金标准”，但人体等效性试验费用高、耗时长且采用健康志愿者，面临伦理学问题。如何采用体外方法代替人体等效性试验是制药界和药品监管机构一直努力探索的问题［1-2］。考虑到溶出度、溶解性和肠道内的渗透性是影响常释口服制剂在体内吸收速度和程度的3个主要因素，Amidon等［3］于1995年提出生物药剂学分类系统(biopharmaceuticsclassificationsystem，BCS)的概念，根据溶解度和渗透性将药物分为4类，即BCS1类，高溶解性-高渗透性;BCS2类，低溶解性-高渗透性;BCS3类，高溶解性-低渗透性;BCS4类，低溶解性-低渗透性。美国食品药品监督管理局(FDA)［4］、欧洲药品管理局(EMA)［5］、世界卫生组织(WHO)［6］等监管机构分别出台了基于生物药剂学系统分类(BCS)豁免的指导原则。2016年原国家食品药品监督管理总局发布了《人体生物等效性试验豁免指导原则》［7］，明确指出对于BCS1类和3类的药物，只要处方中的其他辅料成分不显著影响API的吸收，则不必证明该药物在体内生物利用度和生物等效的可能性，即生物等效性豁免。对于通透性的研究可以采用单层人工培养上皮细胞的方法，Caco-2方法简单、易行、成本低廉，常用于研究药物的渗透性。

盐酸赛庚啶片为药品审评中心(CDE)公布的豁免名单草案中明确豁免BE的品种，但正式公布豁免名单时却将其剔除。本实验通过建立Caco-2细胞模型，研究盐酸赛庚啶在小肠上皮细胞的摄取、跨膜转运及外排作用，阐明盐酸赛庚啶的吸收机制，为其能否生物豁免提供依据。

1 材料与方法

1．1 试剂和仪器 对照品：赛庚啶 (委托方提供);法莫替丁(中国食品药品检定研究院，批号：100305-201304);普萘洛尔 (Sigma-Aldrich，批号：BCBV9430);地高辛(TokyoChemicalIndustry，批号：MERKG-DL);沙丁胺醇(中国食品药品检定研究院，批号：100204-201103);甲苯磺丁脲(Sigma-Aldrich，批号：BCBV8457)。

材料和试剂：Caco-2细胞株(中国科学上海生命科学院细胞库，批号：HTB-37);MEM培养基(Gibco，批号：C11095500BT);胎牛血清(BI，批号：04-001-1ACS);HBSS 溶 液 (Hyclone，批 号：SH30030．02);双 抗(Hyclone，批号：SV30010);0．25%胰酶(Gibco，批号：25200-072);丙酮酸钠(Gibco，批号：11360-070);非必需氨基酸(Gibco，批号：11140-050);L-谷氨酰胺(Gibco，批号：25030-081);依克立达(TargetMol，批号：T2657);4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma-Aldrich，批号：H4034);氯化钠(西陇科学，批号：180329);氯化钾(上海凌峰，批号：20170111);十二水合磷酸氢二钠(西陇科学，批号：171220);磷酸二氢钾(上海凌峰，批号：20170122);荧光黄二钾盐(Sigma-Aldrich，批号：L0144);RIPA细胞裂解液(碧云天，批号：P0013K)。甲醇、乙腈为色谱纯，购自Merck公司，其他溶剂和试剂均为分析纯或以上。

仪器和耗材：Millicell小室(Merck，型号：MCRP24H48);细胞培养板(Sunub，型号：TCP-24);离心机(Dragonlab，型号：DM0412);数显恒温水浴锅(DFS，型号：HH-4);细胞培养箱(Thermo，型号：3111);生物安全柜(Thermo，型号：1384);多功能酶标仪(En-Spire，型号：2300);生物倒置显微镜(Olympus，型号：CKX31);跨膜电阻仪(Millicell-ERS)。

1．2 Caco-2细胞模型的建立和评价 Caco-2细胞以1×105/cm2的密度接种于Millicell悬挂式培养小室中，于接种后的第21天使用Millicell-ERS跨膜电阻仪测定Caco-2细胞的跨膜电阻值。检测Caco-2细胞渗透性：测定300μmol·L-1荧光黄AP-BL侧的通透性。

1．3 荧光黄表观渗透系数的测定 称取适量荧光黄溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成300mmol·L-1母液，临用前用Hanks平衡盐溶液(HBSS)稀释至300μmol·L-1工作液，用于测定Caco-2细胞致密性。后逐级稀释荧光黄储备液配制成1000、500、100、50、10、5nmol·L-1，线性回归计算标准曲线。荧光黄的测定采用PerkinElmer多功能酶标仪，激发波长425nm，发射波长528nm，通过标准曲线计算荧光黄透过率。

1．4 给药液与接收液的配制 供试品和对照品分别称取适量，溶于DMSO配成100mmol·L-1储备液，临用前稀释。Elacridar配制成50mmol·L-1母液，临用前稀释，具体配制方法见表1。

表1 溶液配置方法

1．5 转运试验 生长在Millicell培养小室中的细胞培养23d时，选取细胞电阻值大于300Ω的小室进行药物转运实验。弃去小室培养基，用已预热的转运缓冲液将细胞清洗3遍，第三次加入后置于培养箱中温孵20min。对于AP-BL：分别于AP侧加入200μL顶端给药液，于BL侧加入1000μL基底端接收液;BL-AP：分别于AP侧加入200μL顶端接收液，于BL侧加入1000μL基底端给药液。将培养板置于37℃，5%CO2和95%相对湿度条件下孵育，分别收集接收侧在60、90和120min的溶液100 μL，同时补加100μL空白接收液，其中120min膜两侧均取样100μL，用于计算回收率。

起始给药液即为T0样品，取完样后吸弃细胞板内剩余的溶液，加入终止液200μL裂解细胞，轻轻震摇5min后收集细胞裂解液。

1．6 样品分析

1．6．1 HBSS缓冲液中赛庚啶的检测 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测条件：色谱柱为Poroshell120 PhenylHexyl(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱温为 35 ℃;流动相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流动相B：甲醇;梯度洗脱：0．0～0．6min 为 10%B，0．6～1．0min 为 10%B→80%B，1．0～3．0min 为 80%B，3．10～4．0min 为 10%B;运行时间：4．0min;流速为 0．3mL·min-1;进样量为 5．0 μL。采用MRM模式;离子化方式为电喷雾离子化;离子极性为正离子;离子化电压为5500V;温度为500℃;气帘气为15psi;雾化气为25psi;涡轮气为25psi。赛庚啶和内标的MRM质谱检测参数见表2。前处理方法：精密移取20μL样品于1．5mLEP管中，加入10μL内标溶液，混匀，再加入180μL甲醇，涡旋混匀，20000g，4 ℃，离心 5min，取 80 μL上清液与80μL纯化水，混匀后进样。

表2 赛庚啶的质谱检测参数

1．6．2 HBSS缓冲液中法莫替丁、普萘洛尔和地高辛的检测 法莫替丁的LC-MS/MS检测条件：色谱柱为 ZorbaxSB-C8，(3．5 μm，150mm×4．6mm);柱温为40℃;流动相 A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流动相 B：甲醇;等度洗脱：0．0～3．5min 为 40%B;运行时间：3．5min;流速为 0．8mL·min-1;进样量为5．0μL。离子检测方式为多重反应监测;离子化方式为电喷雾离子化;离子极性为正离子;离子化电压为5000V;温度为450℃;气帘气为28psi;雾化气为55psi;涡轮气为50psi。法莫替丁和内标的MRM质谱检测参数见表3。

表3 法莫替丁的质谱检测参数

普萘洛尔的LC-MS/MS检测条件：色谱柱为Poroshell120PhenylHexyl，(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱温为35℃;流动相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流动相 B：甲醇;梯度洗脱：0．0～0．8min 为 20%B，0．8～1．1min 为 20%B→70%B，1．1～2．0min 为 70%B，2．10～3．5min 为 20%B;运行时间：3．5min;流速为 0．5 mL·min-1;进样量为5．0μL。离子检测方式为多重反应监测;离子化方式为电喷雾离子化;离子极性为正离子;离子化电压为5000V;温度为450℃;气帘气为28psi;雾化气为55psi;涡轮气为50psi。普萘洛尔和内标的MRM质谱检测参数见表4。

地高辛的LC-MS/MS检测条件：色谱柱为Poroshell120PhenylHexyl(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱温为35℃;流动相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流动相 B：甲醇;梯度洗脱：0．0～0．8min 为 20%B，0．8～1．1min 为 20%B→70%B，1．1～2．0min 为 70%B，2．10～3．5min 为 20%B;运行时间：3．5min;流速为 0．5 mL·min-1;进样量为5．0μL。离子检测方式为多重反应监测;离子化方式为电喷雾离子化;离子极性为正离子;离子化电压为-4500V;温度为550℃;气帘气为20psi;雾化气为50psi;涡轮气为60psi。地高辛和内标的MRM质谱检测参数见表5。

表4 普萘洛尔的质谱检测参数

表5 地高辛的质谱检测参数

法莫替丁样品的前处理方法：取30μL样品加入150μL内标工作液(沙丁胺醇)，涡旋5min，20000g，4℃离心10min，取上清液100μL与100 μL水混合，涡旋10min，LC/MS/MS分析。

普萘洛尔和地高辛样品的前处理方法：取30μL样品加入270μL内标工作液(甲苯磺丁脲)，涡旋5 min，20000g，4 ℃离心 10min，取上清液 100 μL 与100μL水混合，涡旋10min，LC/MS/MS分析。

1．7 数据计算 采用如下公式计算表观渗透系数(Papp，cm·s-1)，外排率以及回收率。

Papp=

荧光黄透过到基底端的百分率用以下公式计算：

RFUApical和RFUBasolaterd分别是荧光黄在顶端和基底端的相对荧光强度。VApical和VBasolaterd分别是顶端和基底端的上样体积(分别为0．2mL和1mL)。

2 结果

2．1 赛庚啶HBSS缓冲液中方法学验证 选择性：在该试验条件下，赛庚啶的出峰时间为2．21min，内标甲苯磺丁脲的出峰时间为2．09min。空白样本、赛庚啶以及内标的选择性色谱图见图1。

残留：在标准曲线最高浓度点(ULOQ)后，进样空白样本，未见空白样本中有残留干扰。

标准曲线：以待测物峰面积和内标峰面积的比值对待测物浓度作权重回归计算，选1/c2为权重因子得出标准曲线方程，盐酸赛庚啶：Y=0．000924X+0．00223，r=0．9959(n=8)。表明盐酸赛庚啶在 10～5000nmol·L-1内线性关系良好。盐酸赛庚啶LLOQ为10nmol·L-1，准确度为 93．3% ～ 104．0%，RSD 为4．0%。

稀释效应：超限样品(1000nmol·L-1)稀释10倍后进样分析，结果，样品准确度在 101．5%～107．2%之间，RSD 在 2．1%～15．0%之间。

准确度和精密度：制备浓度为30、200、4000 nmol·L-1的样品，考察准确度和精密度，结果准确度在 104．6%～107．0%之间，精密度在 6．1%～8．2%。2．2 Caco-2细胞单层生长过程中跨膜电阻值的变化及荧光黄的测定 Caco-2细胞接种到小室后，TEER值随着接种的时间逐渐增大，到第3周时TEER值增长缓慢。第21天测定各小室的TEER值，均已超过300Ω·cm2。随机抽取6个小室进行荧光黄测定，荧光黄的透过率均小于2．5%左右，表明本实验中Caco-2细胞单层模型的致密性良好。2．3 对照品法莫替丁、普萘洛尔和地高辛细胞单层的渗透性结果 Caco-2细胞单层致密连接形成后，法莫替丁(50μmoL·L-1)、普萘洛尔(50 μmoL·L-1)的细胞单层渗透性结果见表6。地高辛的外排实验结果见表7。

表6 法莫替丁和普萘洛尔渗透性实验结果

表7 地高辛的外排实验结果

作为低渗的对照药，法莫替丁的平均表观渗透系数［Papp(A-B)］为 2．99×10-6cm·s-1;作为高渗的对照药，普萘洛尔的平均表观渗透系数［Papp(AB)］为20．52×10-6cm·s-1(见表6)。作为外排转运的对照药，不加抑制剂时，地高辛的平均表观渗透系数 Papp(A-B)和 Papp(B-A)值分别为 1．65×10-6cm·s-1和7．56×10-6cm·s-1，外排率为4．57;加入抑制剂时，地高辛的平均表观渗透系数Papp(A-B)和Papp(B-A)值分别为 2．54×10-6cm·s-1和 2．47×10-6cm·s-1，外排率为0．97(见表7)。对照药的溶液回收率为 68．32% ～124．35%，总回收率为 83．90% ～128．04%。因此本研究所采用的Caco-2细胞展示出合格的功能特性。

2．4 赛庚啶双向渗透性结果 Caco-2细胞单层致密连接形成后，盐酸赛庚啶(5、10和 20 μmoL·L-1)的细胞单层渗透性结果见表2。

在给药浓度为5、10和20μmoL·L-1及不含抑制剂的条件下，盐酸赛庚啶在A-B方向的平均表观渗透系数分别为 6．36×10-6、6．14×10-6、23．1×10-6cm·s-1。在B-A方向的平均表观渗透系数分别为16．7×10-6、18．16×10-6、29×10-6cm·s-1，外排率REa，分别为 2．63、2．96、1．26。在给药浓度 5、10 和20μmoL·L-1及含抑制剂的条件下，盐酸赛庚啶在A-B方向的平均表观渗透系数分别为7．74×10-6、15．06×10-6、26．96×10-6cm·s-1。在 B-A 方向的平均表观渗透系数分别为 14．03×10-6、18．51×10-6、21．3×10-6cm·s-1。外排率 REi分别为 1．81、1．23、0．79。盐酸赛庚啶Caco-2细胞中表现出较好的渗透性，同时可能存在外排转运现象，为外排转运体的底物。实验结果见表8。

表8 赛庚啶渗透性及外排实验结果

3 讨论

盐酸赛庚啶片为CDE公布的豁免名单草案中明确豁免BE的品种，但正式公布豁免名单时却将其剔除。溶解性试验中已明确盐酸赛庚啶为高溶解性物质，对于渗透性的考察，高浓度(20μmoL·L-1)表现出高渗透性，当浓度为5、10μmoL·L-1时，渗透系数较20μmoL·L-1下降，同时外排率大于2，存在外排现象。本实验采用依克立达作为外排转运体抑制剂，依克立达为P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)转运体底物，加入依克立达后，外排率降低，说明盐酸赛庚啶可能是P-gp和BCRP转运体底物。而采用Caco-2方法进行渗透性研究仅适用于被动转运的药物(药物的外排率应小于2)［8］。从盐酸赛庚啶的渗透性结果可以看出，渗透随药物浓度的变化而变化，且与转运方向有关。推测未将盐酸赛庚啶作为BE豁免品种可能与其在Caco-2细胞中存在主动转运现象有关。