铁皮石斛叶总黄酮泡腾颗粒剂的制备与抗氧化活性研究

林雪媛，王宇轩，彭意，刘桂燕，谢俊朗，钟桂冬，罗惠玲，张泽蓉，王瑞彬，李艳萍

(1．佛山科学技术学院口腔医学院＜医药工程学院＞，广东 佛山528000;2．广东顺德工业设计研究院＜广东顺德创新设计研究院＞，广东佛山528300)

铁皮石斛是药用石斛中的上品，具有强阴益精、厚肠胃、补内绝不足、轻身延年等功效，自古有“药中黄金”的美誉。铁皮石斛曾是稀缺的野生药材资源，现在通过生物技术已实现大规模种植。2018年5月，铁皮石斛正式进入《药食同源植物名录》。同年6月，铁皮石斛叶、花成为“新食品原料”。

铁皮石斛的种植过程复杂，需要投入大量的人员、技术和资金［1］。《中国药典》规定铁皮石斛以茎部入药，采摘时占鲜条产量约50%的叶子常被丢弃，造成药材资源的严重浪费，也影响着产业经济效益。因此，对铁皮石斛叶进行有效开发利用具有重要意义。

研究发现，铁皮石斛叶中黄酮含量丰富［2-3］，并且具有较好的抗氧化能力，若以黄酮碳苷含量及抗氧化活性为指标，铁皮石斛叶和花代替茎入药有一定可能［4］。黄酮类物质是一种具有多种活性的天然成分，在抗心血管疾病和抗炎等方面有较多的应用。本论文将铁皮石斛叶总黄酮提取物制备成泡腾颗粒剂，并测定其总黄酮的含量以及抗氧化能力。其中泡腾颗粒剂是一种以弱碱和有机酸为崩解剂的速释剂型，投入水中会产生大量气泡，迅速溶解后在水中均匀分布，具有吸收快、生物利用度高、便于运输携带、口感好等特点［5］。

目前市场上铁皮石斛的产品主要以茎部为主，其叶的产品很少，本论文的研究将为铁皮石斛叶的开发利用提供一个参考方向。

1 材料与方法

1．1 仪器 DMF-4B手提式高速中药粉碎机(浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司);JJ300型精密电子天平(常熟市双杰测试仪器厂);10目、18目与80目分样筛(上海宜昌仪器纱筛厂);AS5150B型超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);UV1600PC型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);YE3K165875移液枪(上海求精生化试剂仪器有限公司);RE52-99旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1．2 试剂 铁皮石斛叶(广东国方医药有限公司);碳酸氢钠(北京凌云建材化工有限公司);柠檬酸(广州市海珠区化学试剂厂);药用乳糖(上海华茂药业有限公司);聚乙二醇6000(PEG6000，广州市医药公司);乙醇(广东光华科技股份有限公司);亚硝酸钠(广州试剂厂);DPPH(Sigma公司);Trolox(阿拉丁试剂公司);芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707);氢氧化钠(广州试剂厂);硝酸铝(广州试剂厂);石油醚(60～90℃，广州试剂厂)。

1．3 方法

1．3．1 铁皮石斛叶中总黄酮干粉的制备 将干燥至恒重的铁皮石斛叶捣碎研磨成粉，用滤纸包好，置索氏提取器中，加入石油醚，在80℃水浴中回流脱脂。将脱脂后的粉末置蒸发皿中挥干石油醚，然后置250mL具塞锥形瓶中，加入80%的乙醇进行超声提取，每次提取时间为50min，共提取3次并合并提取液。55℃下减压旋蒸，得到铁皮石斛叶总黄酮浸膏。将所得的浸膏冷冻干燥后即得干粉。

1．3．2 泡腾颗粒剂辅料处方的优化 采取L9(34)正交试验来优化铁皮石斛叶泡腾颗粒剂的处方，铁皮石斛叶总黄酮提取物干粉质量比恒定为6%。以粒度、溶化时间［9］为评价指标，考察乳糖的用量、柠檬酸与碳酸氢钠的配比、PEG6000的用量对泡腾颗粒剂影响。正交试验因素水平表见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

1．3．3 泡腾颗粒剂的制备 取乳糖、铁皮石斛叶总黄酮提取物干粉分别粉碎，过80目筛，各分成2份，备用。

制备碱性颗粒：取PEG6000，加热融化后，加入碳酸氢钠，混匀，冷却，粉碎后过80目筛，备用;取铁皮石斛叶总黄酮提取物干粉于研钵中，按等量递加法加入乳糖和PEG6000包裹的碳酸氢钠混匀，加入适量70%乙醇混合制成软材，过18目筛挤压制粒，置60℃烘箱内干燥(约1h)，过18目筛整粒，再过四号筛(65目)筛去细粉。

制备酸性颗粒：取铁皮石斛叶总黄酮提取物干粉于研钵中，按等量递加法加入乳糖和柠檬酸混匀，加入适量70%乙醇混合制成软材，过18目筛挤压制粒，置60℃烘箱内干燥(约1h)，过18目筛整粒，再过四号筛(65目)筛去细粉。

表2 正交试验设计及结果

将上述两种颗粒混合均匀，即可。

1．3．4 泡腾颗粒剂的检查 颗粒性状检查：取泡腾颗粒3份，每份10g，进行性状检查。

粒度的测定：取泡腾颗粒3份，每份10g，分别称定重量，依次通过一号筛和五号筛，保持水平状态过筛，左右往返，边筛动边拍打3min。取不能通过一号筛和能通过五号筛的颗粒及粉末，称定重量，计算其所占比例(%)。

泡腾时间的测定：取泡腾颗粒3份，每份10g，分别移至盛有200mL水(温度为25℃)的烧杯中，观察并记录泡腾时间。

休止角的测定：采取固定漏斗法［10］，将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上，漏斗下口距纸高度为H，小心地将颗粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗口中，直到锥体尖端触到漏斗下口为止，测定锥体半径R，计算休止角，重复3次。休止角的测定公式为：θ=arctan()，其中 θ为休止角，R为底盘半径。

水分含量测定：取泡腾颗粒3份，每份5g，平铺于干燥的称量瓶中，厚度不超过10mm，精密称定，开启瓶盖在鼓风干燥箱中100℃干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，放冷，称重，称至两次称重不超过5 mg，计算水分含量，重复3次。

1．3．5 泡腾颗粒剂中总黄酮的含量测定［11］标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品0．0100g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成0．2mg·mL-1的芦丁对照品溶液。精密量取芦丁对照品溶液各0．00、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00mL，分别置于 10mL 容量瓶中，各加80%乙醇溶液补足5mL。分别精密加入5%亚硝酸钠溶液0．3mL，摇匀，放置6min。加入10%硝酸铝溶液0．3mL，摇匀，再放置6min。加入1mol·L-1氢氧化钠溶液4mL，最后用80%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。以第一瓶(0．00mL)作空白，用紫外-可见分光光度计在510nm处测其吸收度，作A-C标准曲线(同时计算其回归方程)。

样品含量测定：精密称取泡腾颗粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，定容，得到供试品溶液。精密吸取3份供试品溶液各5mL，按上述标准曲线制备方法进行含量测定，并由标准曲线的回归方程计算各样品中黄酮的含量。

1．3．6 泡腾颗粒剂抗氧化能力的测定［1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH法)］［12-13］对照品 Trolox溶液IC50的测定：精密称取 Trolox0．0010g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成80μmol·L-1的溶液，并将其稀释成 60、40、20 和 10 μmol·L-1。取上述Trolox溶液各2mL，分别精密加入2mL的DPPH溶液，充分混合，室温避光放置50min。用紫外-可见分光光度计测定在517nm处的吸光度，并计算清除率。同时，取2mL的80%乙醇与2mL的DPPH溶液混合后作为阴性对照，空白为80%乙醇。

样品溶液IC50的测定：精密称取泡腾颗粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，用80%乙醇定容，然后将3份溶液分别依次稀释成1、2、3、4、5mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液各2mL，分别精密加入2mL的DPPH溶液，按照对照品的测定方法进行实验，并计算样品溶液的清除率并作清除率-浓度曲线。

2 结果与分析

2．1 泡腾颗粒剂辅料处方优化结果 正交试验结果见表2，粒度方差分析见表3，溶化时间方差分析见表4。由表3可知，对于粒度因素A、B、C的影响均无显著性。由表4可知，对于泡腾时间，因素A、C的影响较大，它们对应的极差也较大，为主要影响因素，B的影响较小。各因素主次顺序为：A＞C＞B。结合表4中各因素极差分析，最终确定最佳辅料处方为A1B2C2，即乳糖含量为40%，柠檬酸与碳酸氢钠的配比为 1．3∶1，PEG6000 含量为 9%。

依据此配方制备铁皮石斛叶总黄酮进行泡腾颗粒剂(见“1．3．4”项下)并对其进行黄酮含量与抗氧化活性研究。

2．2 泡腾颗粒剂检查结果 本实验制备的泡腾颗粒剂颗粒均匀，大小一致，颜色淡黄，气味芳香，不合格的颗粒比例平均值为1．88%(见表5)，从开始泡腾到溶化结束时间平均值为138s(见表6)，水分含量为5．45%(见表7)，结果均符合《中国药典》2015年版(四部)的相关规定。另外，休止角平均值为29．70°(见表8)，说明其流动性好，可以满足生产过程中流动性的要求。

表3 粒度方差分析表

表4 溶化时间方差分析表

表5 粒度检查结果

表6 溶化性检查结果

表7 水分测定结果

表8 休止角测定结果

2．3 泡腾颗粒剂中总黄酮含量测定结果 所得的标准曲线如图 1所示，其方程为：Y=10．395X+0．0015(R2=0．9994)，表明在 0．0118 ～ 0．0590 mg·mL-1范围内线性关系良好。根据此方程计算得到泡腾颗粒剂中总黄酮的含量平均值为(1．29±0．08)mg·g-1。

图1 芦丁对照品标准曲线图

2．4 泡腾颗粒剂抗氧化能力测定结果 DPPH法是常用的抗氧化能力评价方法。阳性对照Trolox的清除率 -浓度曲线见图 2，其 IC50为 22．54 μmol·L-1。泡腾颗粒剂的清除率-浓度曲线见图3，其 IC50为(3．77±0．10)mg·mL-1。结果表明本实验制备的铁皮石斛叶总黄酮泡腾颗粒剂具有良好的抗氧化能力。

图2 Trolox的清除率-浓度曲线

图3 铁皮石斛泡腾颗粒剂的清除率-浓度曲线

3 讨论与结论

目前市面上铁皮石斛叶的产品还较少，相关剂型还有待进一步开发。因此研究开发铁皮石斛叶中的黄酮类化合物具有广阔的前景。本文将叶中的黄酮提取物制备成具有良好抗氧化能力的泡腾颗粒剂，为铁皮石斛叶资源的开发与利用提供了一个可行的方向。

中药提取物一般容易吸湿，影响制剂的工艺。为减少泡腾颗粒吸湿，选用吸湿性较小的乳糖作为稀释剂，同时采用等量递加法将铁皮石斛叶提取物干粉与乳糖等辅料混匀。这样一方面降低了颗粒与主药的吸湿性，另一方面使主药分散均匀，保证制剂的均一性。另外，采用PEG6000包裹碳酸氢钠，并把酸碱颗粒分开制粒，这样可以有效地隔离了酸源与二氧化碳源，保证制剂的稳定。

辅料的选择与泡腾剂的处理对泡腾颗粒剂的制备也很重要。辅料要选水溶性强且吸水性弱的，否则泡腾时间会不达标且易在包装袋中膨胀。PEG6000与碳酸氢钠混合过程中，应先将PEG6000充分加热溶解，然后稍冷片刻再加入研磨后的碳酸氢钠粉末。否则碳酸氢钠在高温下易受热分解，释放出二氧化碳，会影响泡腾效果。