丹红注射液对大鼠深静脉血栓形成模型的作用研究

刘丽亚，薛云，戴晓莉

(1．南方医科大学深圳医院，广东深圳518110;2．山东省药学科学院，山东济南250100)

丹红注射液是由丹参和红花提取分离的复方中药制剂。丹红注射液的主要功效为活血化瘀和通脉舒络，临床上用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风、冠心病、心绞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓等［1-4］。尽管中药注射液在国内临床上应用广泛，但其疗效不确切，安全事故频发，故国内外对中药注射液争议较大。2017年深化药品器械医疗审评审批制度改革的重点工作之一就是中药注射液的有效性和安全性再评价工作。本实验室按照中药注射剂再评价要求，采用下腔静脉阻断法制备大鼠静脉血栓模型，通过检测出血时间、血浆纤维蛋白原含量、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和血栓重量等指标，全面考察丹红注射液对大鼠下腔静脉阻断血栓模型的改善作用，以期为丹红注射液的临床应用提供实验依据。

1 材料

1．1 动物 SD大鼠200～220g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。SPF级动物房［SYXK(鲁)2014-0008］饲养。温度20～26℃，日温差≤4℃，湿度40%～70%，换气次数8～10次/h，动物自由饮食饮水。

1．2 药品与试剂 丹红注射液(菏泽步长制药有限公司提供，批号：150832);阿加曲班注射液(天津药物研究院药业有限责任公司，批号：20150634);纤维蛋白原、凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间试剂盒均由上海太阳生物技术有限公司提供。

1．3 仪器 AY220型电子分析天平(岛津有限公司);C2000型血凝仪(北京东方普利生科贸有限公司);TDL-5台式低速大容量离心机(江苏金坛市医疗仪器厂)。

2 方法

2．1 剂量设计 丹红注射液临床用法为成人每天8 mL。按成人70kg和200g大鼠等效剂量折算系数法可得大鼠用药剂量为 8mL×0．018×5=0．72 mL·kg-1，故本试验可设丹红注射液低、中、高剂量分别为 0．5、1、2mL·kg-1。

2．2 大鼠深静脉血栓形成模型的建立［4-5］取健康雄性大鼠60只，按体重随机分为6组，分伪手术组、模型组、丹红注射液 2、1、0．5mL·kg-13 个剂量组和阿加曲班注射液1．8mg·kg-1阳性对照组。手术前所有动物禁食12h，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉，仰卧固定，备皮消毒，于下腹部正中纵行3～4cm切口打开腹腔，分离腹主动脉和下腔静脉，将4号丝线与下腔静脉并行，用Prolene线将肾静脉至髂静脉水平的下腔静脉与丝线一起结扎，并在结扎线下方用血管阻断夹夹住血管，然后将丝线抽出后取下血管阻断夹。手术完成后关闭腹腔，术后仔细护理至大鼠清醒。伪手术组所有操作同模型组，但不结扎和夹闭血管。造模后各给药组尾静脉给予相应剂量的药物溶液，10mL·kg-1，每天给药1次，连续给药3d，模型组和伪手术组给予等容积的生理盐水。

2．3 指标检测［4-5］给药前和末次给药后5h，用锋利的刀片横切大鼠尾部5mm，每30s用滤纸吸去，直至出血停止，记录出血时间。药后6h，重新打开腹腔，从后腔静脉上段取血，测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原含量(FIB)。取血同时，在结扎下方2cm处夹闭管腔，取出瘀血段血管，剖开管腔，取出血栓，放在滤纸上，吸干血液，称取血栓湿重(mg)，然后将血栓置培养皿中在室温下放置24h，称取血栓干重(mg)。

2．4 数据处理与统计学方法 采用DAS2．0软件进行数据统计。各组实验数据采用表示，组间指标数据比较采用t检验。采用P＜0．05或0．01表示统计差异性。

3 结果

3．1 对模型大鼠出血时间的影响 伪手术组大鼠给药前后出血时间未见明显变化，模型组大鼠造模后出血时间一定程度降低，但未见统计学差异。丹红注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8 mg·kg-1剂量组大鼠给药后出血时间与给药前比较均显著延长(P＜0．05或 P＜0．01)。丹红注射液 2 mL·kg-1与阿加曲班注射液1．8mg·kg-1剂量组大鼠的出血时间未见统计学差异(P＞0．05)，而丹红注射液1、0．5mL·kg-1剂量组大鼠出血时间明显短于阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1剂量(P＜0．05 或 P＜0．01)，结果见表 1。

表1 丹红注射液对模型大鼠出血时间的影响(，n=10)

表1 丹红注射液对模型大鼠出血时间的影响(，n=10)

注：与给药前比较，*P＜0．05，＊＊ P＜0．01;与给药前比较，#P＜0．05，##P＜0．01

组别 剂量 给药前出血时间/s给药后出血时间/s伪手术 - 477±226 495±211模型 - 462±129 376±151阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 488±135 962±167＊＊2mL·kg-1 447±147 853±137＊＊丹红注射液 1mL·kg-1 480±138 722±120*#0．5mL·kg-1 459±148 583±139##

3．2 对模型大鼠凝血时间和血浆纤维蛋白原含量的影响 与伪手术组比较，模型大鼠血浆纤维蛋白原含量升高，凝血时间延长。与模型组比较，丹红注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1剂量组大鼠给药后TT、APTT和PT显著延长，血浆纤维蛋白原含量明显降低(P＜0．05或 P＜0．01)，结果见表2。

表2 丹红注射液对模型大鼠凝血时间和纤维蛋白原含量的影响(，n=10)

表2 丹红注射液对模型大鼠凝血时间和纤维蛋白原含量的影响(，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0．05，＊＊P＜0．01;与伪手术组比较，##P＜0．01

组别 剂量 APTT/s PT/s TT/s FIB/g·L-1伪手术 - 21．3±1．1 12．3±1．3 30．7±1．2 1．84±0．45模型 - 19．6±1．8# 11．0±0．8# 29．2±1．0# 2．68±0．36##阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 24．5±0．9＊＊ 16．8±1．4＊＊ 35．9±1．2＊＊ 1．78±0．24＊＊2mL·kg-1 22．9±1．9＊＊ 15．8±1．2＊＊ 33．8±1．5＊＊ 1．91±0．32*丹红注射液 1mL·kg-1 21．5±1．4* 13．2±1．7* 31．9±1．6* 2．03±0．27*0．5mL·kg-1 20．4±1．3 11．9±1．2 29．8±1．5 2．22±0．46

3．3 对模型大鼠血栓重量的影响 伪手术组未见血栓形成，模型大鼠出现明显血栓。与模型组比较，丹红注射液2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液1．8 mg·kg-1剂量组大鼠给药后血栓湿重和干重均明显降低(P＜0．05 或 P＜0．01);而丹红注射液 0．5 mL·kg-1剂量组大鼠血栓重量亦有所降低，但未见统计学差异。结果见表3。

表3 丹红注射液对模型大鼠血栓重量的影响，n=10)

表3 丹红注射液对模型大鼠血栓重量的影响，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0．05，＊＊P＜0．01

组别 剂量 血栓湿重/g 血栓干重/g伪手术 - - -模型 - 20．9±3．8 5．4±1．3阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 14．2±2．9＊＊ 3．4±1．1＊＊2mL·kg-1 16．5±3．2* 3．6±0．9＊＊丹红注射液 1mL·kg-1 18．1±1．8* 4．0±0．8*0．5mL·kg-1 19．1±2．8 4．5±0．6

4 讨论

利用大鼠制备深静脉血栓形成(DVT)动物模型已有60多年的历史，共有18种动物可用于DVT的模型制备。大鼠与犬、猪等实验动物相比复制DVT模型具有重复性好、费用低等优点，故采用较多。肾静脉血栓形成最重要的3个因素为血流淤积、静脉内皮损伤及血液高凝集。因此要围绕这3种因素，选择合适的处理方式进行DVT模型制备。通过接扎静脉模拟血流淤积是最简便、应用最多模型制备方式。本文通过缩窄下腔静脉，同时血管阻断夹阻断并结扎肾静脉至髂静脉水平的下腔静脉各属支的方法，建立了大鼠DVT疾病模型［6］。结果显示，模型组大鼠凝血时间缩短，纤维蛋白原含量升高，出现明显的血栓，证明模型制备成功。

预测血栓形成的独立危险因素之一就是纤维蛋白原，纤维蛋白原水平升高后心血管事件的发生率亦明显升高。纤维蛋白原为血液中含量最高的凝血因子，其含量升高可明显促进血液凝固和血小板聚集。纤维蛋白原转变为纤维蛋白和不溶性降解产物后启动血栓形成的过程;纤维蛋白原和红细胞均为决定血液黏度的最重要因素，其水平升高可增加血浆黏度和改变血流变指标，进而促进血栓形成［7］。本试验结果证明，模型组纤维蛋白原含量明显升高，丹红注射液1mL·kg-1剂量以上可显著降低纤维蛋白原含量，延长出血和凝血时间，明显降低模型大鼠肾静脉血栓干重和湿重，对肾静脉血栓形成有明显的抑制作用。其作用机制可能为通过其有效成分迷迭香酸、丹参酚酸和对香豆酸来抑制多个诱导血小板黏附、聚集及其下游钙离子和cAMP信号通路的G蛋白耦联受体激动剂而发挥作用［8-9］。