载巯基化阿霉素的中空金纳米粒的制备与光热性能研究

杨二爽，杨文倩，夏云，沈雁

(中国药科大学药学院，江苏南京210009)

金纳米粒(goldnanoparticles，AuNPs)是一种非常有前景的药物载体，能够有效地将药物输送到不同的细胞类型并释放药物。金纳米粒作为药物载体具有许多理想的特性［1-3］，例如化学性质惰性、良好的生物相容性。此外，金纳米粒具有较大的比表面积，能够以共价键和物理吸附的方式负载药物。研究表明，空腔结构的金属纳米颗粒因为其特殊的结构而提供了较大的吸收截面，使得光热转换效率比实心金属纳米颗粒更高［4］，可以通过局部高温有效地杀死癌细胞，在肿瘤治疗中很有前景。

药物与金纳米粒相连，一般是经过共价作用或非共价作用。采用非共价作用连接药物-金纳米粒的方法虽然简单快捷，但是在生物体内的组织和细胞微环境中，结合在金纳米粒表面的药物分子并不十分稳定。而通过共价作用连接的药物-金纳米粒则提高了药物分子在体内环境的结合稳定性。金纳米粒易被巯基、氨基等基团修饰，所以某些分子结构中含有巯基的药物可以与金纳米粒形成Au-S共价键，直接结合到金纳米粒表面，结构中不含巯基的药物则需要通过一些化学修饰形成巯基，再结合到金纳米粒表面［5］。因此，本实验以抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型药物，通过化学修饰制备巯基化阿霉素(DOX-SH)，使之与中空金纳米粒(HGNPs)相连，构成阿霉素-中空金纳米粒复合载药体系(HGNPs-DOX)，对其结构进行表征，并验证其光热转化能力和细胞毒性。

1 仪器与材料

1．1 仪器 NewClassic电子天平ML系列(南京科翔仪器设备有限公司);85-1型磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);BHX型电热恒温鼓风干燥箱(南京科尔仪器设备有限公司);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);UPK-I-10T超纯水机(成都超纯科技有限公司);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);1KD透析袋(南京助研生物科技有限公司);752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AVANCEAV-500核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司);Agilent1100 LC/DAD/MSD液质联用仪(美国Agilent公司);808 nm耦合激光器(宁波远明激光技术有限公司)。1．2 药品与试剂 盐酸阿霉素(含量＞99%，批号：20150801，武汉远成共创科技有限公司);三乙胺(AR，批号：20140728，国药集团化学试剂有限公司);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，AR，批号：20160106，国药集团化学试剂有限公司);乙酸乙酯(AR，批号：181017821K，南京化学试剂股份有限公司);氯化钠(AR，批号：1801052，西陇化工股份有限公司);盐酸羟胺(AR，批号：1706101，上海试四赫维化工有限公司);琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯 (SATA，＞94%，批号：160308，阿拉丁);氯金酸(AR，批号：180920，上海科峰实业有限公司);二水合柠檬酸三钠(AR，批号：15011，南京化学试剂有限公司);硼氢化钠(AR，批号：151029067F，南京化学试剂有限公司);氯化钴(AR，批号：1708092，西陇科学股份有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，批号：181004，安徽山河药辅有限公司);噻唑蓝(MTT，批号：170209，江苏凯基生物技术股份有限公司)。

1．3 细胞 人非小细胞肺癌(A549，江苏凯基生物技术股份有限公司)。

2 实验与方法

2．1 DOX-SH 的合成

2．1．1 DOX-SATA的合成 参考文献中的制备方法［6］。精密称取 10．5mgDOX 和 25．2mgSATA 置25mL茄形瓶中，加入3mLDMF使溶解，加入三乙胺6μL，用磁力搅拌器搅拌反应3h(避光)，反应后的溶液加入5mL水进行稀释，用乙酸乙酯进行萃取，用饱和食盐水洗涤，于旋转蒸发器中蒸发浓缩，40℃真空干燥。得到DOX-SATA，称重，除以理论产量，计算回收率。

2．1．2 DOX-SH 的合成 参考文献中的制备方法［4］。取纯化后的第一步反应产物DOX-SATA适量，溶于甲醇中，加入盐酸经胺(DOX-SATA和盐酸羟胺的摩尔比为1∶100)，加入适量三乙胺调节pH为7．4，氮气保护，避光反应12h。旋转蒸发除去大部分有机溶剂，40℃真空干燥，得到DOX-SH，称重除以理论产量，计算回收率。

2．2 DOX-SH 的表征

2．2．1 质谱 分别取 DOX、DOX-SATA、DOX-SH 适量，以CD3OD为溶剂，进行质谱分析，记录MSESI图谱。分析DOX、DOX-SATA、DOX-SH的分子量。

2．2．2 氢谱 分别取 DOX、DOX-SATA 适量，以CD3OD为溶剂，频率500MHz，测试温度为25℃，进行氢谱分析，记录1H-NMR图谱。分析DOX、DOXSATA的特征氢化学位移。

2．3HGNPs-DOX 的制备

2．3．1 HGNPs的制备 在500mL三颈烧瓶中加入300mL 超纯水，依次加入 6mL0．05mol·L-1的柠檬酸三钠溶液、300μL20%PVPK30溶液和300 μL0．4mol·L-1的氯化钴溶液，抽真空。加入3mL 0．1mol·L-1的硼氢化钠溶液，变色后搅拌 15min，使过量的硼氢化钠迅速水解产生氢气;加入900μL 25mmol·L-1氯金酸溶液，30s后通入空气搅拌5 min，使剩余的内部钴纳米粒核心被氧化，即得HGNPs溶液［7］。

2．3．2 HGNPs-DOX的制备 取一定量 HGNPs溶液置10mL离心管中，向HGNPs溶液中加入适量DOX-SH溶液，在37℃下孵育8h。将孵育结束后的HGNPs-DOX溶液转移至10mL离心管中，10000rpm离心15min，弃去上清液中未反应的DOX-SH，用超纯水复溶［8］。

2．4HGNPs-DOX 的表征

2．4．1 HGNPs-DOX的粒径分布和Zeta电位 取3 mLHGNPs-DOX溶液，使用激光粒度分析仪测定样品的粒径分布和Zeta电位，每个样品测定3次。

2．4．2 等离子共振(SPR)吸收峰 取制备好的HGNPs和HGNPs-DOX溶液3mL，以超纯水作为空白溶液。采用紫外分光光度计测定溶液的等离子共振吸收峰和吸收光谱。测量波长范围为400nm至1000nm。

2．4．3 HGNPs-DOX的形态表征 利用TEM 观察HGNPs-DOX的形态。吸取少量HGNPs、HGNPs-DOX溶液(5mg·mL-1)滴在碳支持膜表面，2～3 min后用滤纸吸去残留液体，将样品置于红外灯下干燥，使用TEM观察形态特征。

2．4．4 HGNPs-DOX的体外光热转化能力 分别配制 0．075、0．15 和 0．30mmol·L-1的 HGNPs 和HGNPs-DOX溶液，各取1mL置石英比色皿中，使用808nm波长激光以1W·cm-2的功率照射10 min，每隔1min使用红外热成像仪记录温度变化(以pH7．4磷酸盐缓冲液作为对照)。另取0．30 mmol·L-1的HGNPs-DOX溶液，使用808nm波长激光以1W·cm-2照射2．5min，记录温度值，并冷却至室温，重复10次，记录每次温度变化。

2．4．5 细胞毒性实验 采用 MTT法考察 DOX和HGNPs-DOX的体外细胞毒性和激光照射后HGNPs-DOX的细胞毒性。将生长状态处于对数生长期的A549细胞加入96孔板中，使每孔大约1×105个细胞。培养24h后，弃去培养液，加入含相同DOX浓度的DOX、HGNPs-DOX溶液，每孔加入200μL，另设置HGNPs-DOX组别，给予1W·cm-2的近红外光照射5min。培养24h后，弃去培养液，每孔加入100 μL0．5mg·mL-1的 MTT 溶液。培养 4h 后，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，于490nm测定各样品吸光度(A样品)。同时测定调零孔(A空白)和对照孔(A对照)的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

3 结果与讨论

3．1 DOX-SH 的合成

3．1．1 DOX-SATA的合成 以 DOX和 SATA为原料，在三乙胺的催化下，SATA上琥珀酰亚胺和DOX的伯胺根据确定的摩尔比反应生成DOX-SATA，反应式见图1。产物为红色粉末状固体，不溶于水，溶于甲醇等有机溶剂。产率为90．42%。

图1 DOX-SATA和DOX-SH的合成

3．1．2 DOX-SH的合成 DOX-SATA的乙酰基硫代乙酸酯在盐酸羟胺的作用下脱去乙酰基团，最终在DOX分子上连接游离的巯基基团，反应式见图1。产物为红色粉末状固体，不溶于水，溶于甲醇等有机溶剂。产率为78．53%。

3．2 DOX-SH 的表征

3．2．1 质谱 DOX、DOX-SATA和DOX-SH的质谱图见图2。由DOX和DOX-SATA的质谱图可以看出，DOX的分子离子峰为544．2，DOX-SATA的分子离子峰是659．2，相差一个硫酯基团的分子量，说明硫酯基团连接到DOX上，结果与理论值相符合。而DOX-SH中出现了616．6的分子离子峰，与DOX-SATA的分子离子峰相差43，为脱去的乙酰基的分子量，与文献相符。DOX-SH的质谱图中，出现了大于616的分子离子峰，推测可能是DOX-SH在反应过程中，巯基被氧化，形成了二硫键，DOX-SH分子之间发生了交联。

图2 质谱图

3．2．2 氢谱 DOX和DOX-SATA的1H-NMR谱图见图3。与DOX的谱图相比，DOX-SATA的谱图中在2．5ppm左右出现了两个新的质子峰，此为硫酯基团上的质子峰，证明合成的产物中含有硫酯基团。结果与文献相符。

图3 1H-NMR谱图

3．3HGNPs-DOX 的制备

3．3．1 HGNPs的制备 采用钴模板法制备了 HGNPs，其外观如图4(a)所示，所制备的HGNPs呈透明澄清的绿色。外观均一，无沉淀出现。

图4 HGNPs和HGNPs-DOX外观图

3．3．2 HGNPs-DOX的制备 采用钴模板法制备了中空金纳米粒，其外观如图4(b)所示，所制备的HGNPs-DOX呈透明澄清的灰色，无聚集颗粒或者沉淀出现，外观均一，与HGNPs相比，颜色偏灰。

3．3．3 HGNPs-DOX 的粒径分布和 Zeta 电位

HGNPs和HGNPs-DOX的粒径分布见图5。HGNPs的粒径为(53．00±0．196)nm，Zeta 电位为(-55．44±3．88)mV;与 HGNPs相比，HGNPs-DOX 的粒径稍有增加为(72．00±0．131)nm，Zeta 电位为(-39．51±3．62)mV。HGNPs和HGNOPs-DOX的粒径逐渐增大。

3．3．4 等离子共振(SPR)吸收峰 如图6所示，所制备的HGNPs等离子共振吸收(SPR)吸收峰最大吸收波长为780nm左右;HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波长为800nm。金纳米粒可以吸收近红外光，这使其可以将光能转化为热能。而SPR最大吸收波长在808nm附近的HGNPs，光热转化的效率更高。以上结果表明，HGNPs和HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波长为800nm左右。HGNPs、HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波长依次出现红移。

图5 粒径分布

图6 吸收光谱图

3．3．5 HGNPs-DOX 的形态表征 HGNPs 和HGNPs-DOX在透射电镜下的形态图见图7。可以看出制备好的HGNPs外形呈圆球形，内部具有空腔结构，其粒径约为50nm左右，壳厚为4～6nm，这与实际测得的粒径也相符合。HGNPs-DOX仍然呈现出空腔结构的圆球形，但在其外表有一层透明的膜状物，其厚度大约为5nm左右。HGNPs-DOX的粒径大于HGNPs，一方面是因为阿霉素负载到其表面，另一方面可能是由于阿霉素的负载，使得HGNPs表面水化层的存在。

图7 透射电镜下的形态图

图8 HGNPs(a)和HGNPs-DOX(b)的温度变化与重复10次照射后HGNPs和HGNPs-DOX(c)的温度变化

3．3．6 HGNPs-DOX的体外光热转化能力 由图8可以看出，HGNPs和HGNPs-DOX的体外光热转化能力呈时间依赖和剂量依赖性。在较低浓度时，与PBS相比，HGNPs和HGNPs-DOX在808nm波长激光照射下，其温度随时间的延长而显著增加。且温度变化随浓度的增加而增加。而HGNPs和HGNPs-DOX相比，两者在不同浓度下的温度增加无明显差异。采用808nm波长激光照射2．5min，并重复10次，可以看出HGNPs和HGNPs-DOX在每次照射以后达到的最高温度都在60℃左右，且HGNPs和HGNPs-DOX的温度变化无显著性差异。这提示在多次照射以后，金纳米粒的光热转化能力并不会降低。以上结果表明，制备得到的HGNPs-DOX可以将光能转化为热能，具有良好的体外光热性能，这为其后期的热疗研究提供了可能。

3．3．7 细胞毒性 加入DOX、HGNPs-DOX的细胞存活率见图9所示。可以看出，DOX对A549细胞具有较大的毒性，其 IC50为 11．24μg·mL-1。在较高浓度下，中空金纳米粒能有效地降低阿霉素对细胞的毒性。采用1W·cm-2的近红外光照射5min以后，在高浓度下，其细胞毒性增加，可能是由于在近红外光的照射下，阿霉素从载体中释放出来。而较低浓度时细胞毒性无明显变化，可能是由于在浓度较低时，阿霉素的细胞毒性较小。以上结果表明，将阿霉素负载到HGNPs上，能显著降低阿霉素的毒性，且在近红外光的照射下能够促进阿霉素的释放，使得细胞存活率降低。

图9 DOX、HGNPs-DOX的细胞存活率(n=6，*P＜0．05，＊＊P＜0．01)

4 小结

本实验采用SATA试剂制备了DOX-SH，该方法操作简单，合成过程副反应较少，产率较高，方法较为可行。制备了HGNPs-DOX，其粒径70nm左右，粒径均一，分散性能良好，最大吸收波长为800 nm左右，光热转化实验证明该材料具有很好的光热性能，细胞毒性实验表明该材料具有较小的毒性，且近红外光的照射能够促进DOX的释放。本研究为金纳米粒载药系统研究用模型药物的巯基化，提供了一种较为可行的合成方法。其次，HGNPs-DOX载药体系可以用于化疗联合热疗研究，具有极大的研究价值。