脑缺血再灌注损伤中关键蛋白的研究进展

孟文静，陈真

(中国药科大学药学院，江苏 南京 211198)

脑血管疾病是一种常见的临床疾病，其中以脑缺血性卒中最为常见，缺血性卒中是世界上导致死亡的第三大原因，其并发症包括偏瘫，昏迷甚至死亡。恢复缺血区域的脑灌注并尽快挽救缺血半影中的神经元是脑梗死治疗的核心问题。然而，供应给缺血区域血液的恢复也可能诱发进一步的组织损伤和功能障碍，这被称为缺血再灌注(I/R)损伤[1]。研究表明，72%的缺血再灌注损伤是由再灌注损伤引起的，在几种动物缺血性中风模型中，缺血后长时间再灌注可导致比永久性血管结扎更严重的脑梗死[2]。因此，减少脑I/R损伤已成为缺血性脑血管病治疗的关键。

目前研究脑缺血再灌注损伤的机制尚未完全明确，但可以确定的是与自由基生成，脑能量衰竭，脑血屏障(BBB)损伤，炎症和细胞凋亡有关。相对应的一些兴奋性氨基酸调控药物、自由基清除剂、神经营养因子、钙离子拮抗剂、一氧化氮合酶抑制剂、抗凋亡药物在临床得到广泛研究和应用。因此寻找脑缺血再灌注中的关键蛋白，研发靶点药物已成为治疗缺血性脑损伤的关键一步。

1 Notch1信号通路

Notch基因于1917年由托马斯·亨特·摩根(Thomas Hunt Morgan)发现，是一种普遍存在的信号通路，在小鼠和人类中，存在4种Notch受体和5种Delta/Serrate/Lag2(DSL)配体，其被称为Jag1和Jag2和Delta样(Dll)，Dll3和Dll4。该通路通过直接细胞-细胞相互作用激活，促进信号细胞上Notch配体(Dll1、Dll3、Dll4、Jagged-1和Jagged-2)与相应细胞上的Notch受体之间的结合。配体结合后，Notch被γ-分泌酶和肿瘤坏死因子α(TNF-α)切割以释放受体细胞内结构域(NICD)，其易位至细胞核并与转录因子结合，通过调节细胞间接触依赖性通讯、细胞分化、增殖和凋亡参与许多关键生理学和病理过程[3]。

该途径除在胚胎发育有重要作用外，在脊椎动物和无脊椎动物的成熟大脑中也显示出关键功能，包括神经祖细胞调节，神经元连接，突触可塑性和学习记忆。Notch信号传导抑制许多生物体中的神经分化，抑制少突胶质细胞发育并刺激神经胶质细胞的分化。Notch也是发育阶段神经干细胞维持和自我更新的关键调节因子，在神经退行性疾病中受到异常调节[4]，是发育阶段神经干细胞维持和自我更新的关键调节因子[5]，在神经祖细胞分化和中枢神经系统损伤后的炎症反应中起重要作用。

研究表明，缺血/缺氧预处理可以增强缺氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达，而VEGF是Notch1信号通路的上游[6]。Guan等[7]在研究中，建立了大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型，发现MCAO/R可引起脑梗死，海马神经元损伤和细胞凋亡，并激活Notch1信号通路。Shi等[8]的研究表明，miR-137通过靶向Notch1来调节Notch信号通路以保护神经元免受OGD / R诱导的细胞损伤。Yan等[9]的研究发现天然香豆素衍生物蛇床子素(Ost)上调基因Notch 1和Hes 1的表达，当Notch活性被γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断时，Notch 1和Hes 1 mRNA的表达下调。因此，在脑缺血治疗研究中，Notch信号转导通路可作为重要靶点。

2 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路

Akt是一种57kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径的主要已知效应物。其以低活性形式位于细胞质中，当细胞被细胞外信号(例如缺血或缺氧)刺激时，Akt的C末端Ser 473残基被磷酸化激活以调节上游分子，参与涉及许多生物过程的多种信号传导途径，包括细胞存活、凋亡、增殖和分化。PI3K/Akt信号传导途径是将细胞膜受体信号转导入细胞内信号的重要模式，近年来，PI3K/Akt细胞存活信号通路在脑损伤领域得到越来越多的研究，该途径的激活在炎症、血栓形成和血管通透性方面具有抑制作用，从而产生保护血管功能。Akt在缺氧缺血后作为脑中的存活激酶，通过磷酸化其底物以防止炎症和细胞凋亡而起到存活激酶的作用。许多化合物(如生长因子、雌激素、自由基清除剂和其他神经保护剂)通过上调p-Akt来减少缺血性损伤。研究证实，PI3K/Akt信号通路也是参与脑内神经元凋亡的主要途径之一[10]。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是由两种同种型GSK-3α和GSK-3β组成的丝氨酸/苏氨酸激酶，Akt最重要的下游靶标之一就是GSK-3β，GSK-3β中第9位丝氨酸的磷酸化抑制GSK-3β的活性。在神经元中，GSK3β参与神经元微管动力学，并通过磷酸化其下游靶标来调节未成熟神经突的延伸和回缩，在细胞增殖、分化、运动、凋亡和炎症方面有重要作用。而活化的Akt通过与GSK-3β结合，诱导GSK-3β易位至细胞膜，使N-末端Ser活性位点磷酸化，从而使GSK-3β失活，抑制GSK-3β活性[11]。GSK3β活性的增加与神经元凋亡的增加相关，并且GSK3β活性的增加先于细胞凋亡的诱导，添加抑制性GSK3β结合蛋白或失活形式的GSK3β可降低凋亡水平[12]。

Zhang等[13]的研究发现山柰酚(KF)的心脏保护是通过对Akt/GSK-3β信号传导途径的调节发挥作用的。Wang等[14]在研究一种人参皂苷(HN)的变体HNG时，发现其治疗改善了小鼠实验性ICH后的功能和形态学结果，并且与PI3K/Akt/GSK-3β信号通路抑制细胞凋亡有关。PI3K/AKT/GSK-3β信号通路可作为脑缺血治疗研究中一重要通路。

3 PI3K/AKT/mTOR信号通路

mTOR是雷帕霉素在哺乳动物细胞中的分子靶标，是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR蛋白以两种形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTOR是细胞生长和代谢的关键调节因子，增加mTOR活性可减弱自噬并恢复细胞中溶酶体的完整性。磷酸化形式的Akt和mTOR在PI3K/Akt/mTOR途径的细胞保护中起主要作用，激活PI3K/Akt/mTOR可促进中枢神经系统(CNS)损伤后的神经保护作用[15]。

有证据表明，阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路可能是诱导细胞凋亡和抑制增殖的关键途径[16]。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与机械损伤后神经元的凋亡，并可通过线粒体途径诱导细胞凋亡，同时PI3K/Akt/mTOR信号传导途径与自噬的起始密切相关。 Akt的下游磷酸化可以激活TSC1/2，其进一步促进mTOR活化。mTOR通过抑制下游分子复合物ULK1来负调节自噬水平。

Pan等[17]发现黄角颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的保护作用可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活有关，其对模型组大鼠脑组织IL-10、PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达均有明显的上调作用，IL-1β和TNF-α在脑组织中的表达明显增强。Li等[18]研究发现雷公藤内酯(TP)也通过PI3K/Akt/mTOR通路产生神经保护作用。

4 JAK2/STAT3

信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白包含在细胞质中的转录因子家族之中，其参与细胞因子，生长因子和激素信号传导之后的分化、增殖、存活、凋亡和血管生成。 STATs由酪氨酸磷酸化激活，酪氨酸磷酸化通常是瞬时并且紧密调节过程。STAT可根据其特定功能分为两组：一种由STAT2、STAT4和STAT6组成，它们被少量细胞因子激活，并在T细胞发育和γ-干扰素(IFNγ)信号传导中发挥作用。另一组包括STAT1、STAT3和STAT5，它们通过一系列配体在不同组织中激活，并参与IFN信号传导、乳腺发育和胚胎发生，在控制细胞周期进程和细胞凋亡中也起重要作用，受体相关酪氨酸激酶JAK家族由4个成员组成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它们以受体二聚化或寡聚化的方式以部分特异性方式激活。STAT3被磷酸化-JAK2(pJAK2)磷酸化并随后转移至细胞核，在细胞核通过与含有γ-激活序列的基因的启动子区域结合来调节其靶基因的转录。JAK/STAT信号通路还可以调节癌细胞的生物学特性，如增殖、生长、分化、迁移和侵袭[19]。研究表明，JAK2 /STAT3信号通路在氧化应激损伤的细胞和动物模型中被激活[20]，一旦发生缺血性卒中，p-STAT3的表达显著增加。

多项研究表明，激活JAK2/STAT3信号通路对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用[21-23]。Hou等[24]研究还发现白藜芦醇可以通过激活JAK2/STAT3间接上调PI3K/AKT/mTOR通路，增加BCL-2的表达但降低缺血/再灌注时BAX和切割的caspase-3表达，减少TUNEL阳性细胞的数量。银杏内酯(GK)通过JAK2/STAT3途径增加HIF-1α/VEGF的表达促进缺血性脑卒中后血管新生[25]。

5 TLR4/NF-κB信号通路

小胶质细胞被认为是脑组织中的主要免疫效应细胞，而免疫系统中主要的受体类型是Toll样受体(TLRs)。Toll样受体(TLRs)是跨膜蛋白的一员，是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，是哺乳动物中唯一将细胞外抗原信息转导入细胞并引发炎症反应的分子。所有TLR中，Toll样受体4(TLR4)是TLR中首个被发现的，它是一种富含亮氨酸的跨膜蛋白，通过识别和结合多种内源和外源配体在免疫防御和免疫调节中发挥作用，TLR4通过膜转导这些信号，随后调节其表达。TLR4刺激丝裂原活化蛋白(MAP)和应激激酶，如细胞外调节激酶(ERK)1/2，p38和Jun激酶(JNK)1/2，进而激活核内炎症的转录调节因子[26]。

研究表明，在缺血或缺血再灌注损伤后，肾小管上皮细胞和肾脏白细胞中发现TLR4的上调[27]。TLR4也在肝脏、肺脏和心脏的缺血再灌注炎症损伤中起作用，并在脑缺血再灌注中诱导细胞凋亡。TLR的激活通常导致NF-κB的核转位，NF-κB是一种广泛使用的转录因子，可以特异性结合许多基因的启动子和增强子，从而参与多种细胞功能，如炎症、免疫反应、血液生成、细胞增殖和凋亡。NF-κB活化导致表达不同的促炎细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-8，因此抑制脑NF-κB活化与神经保护作用相关。TLR4信号通路的下调或表达下调可能在缺血模型中发挥保护作用。

Han等[28]通过建立MCAO模型，发现针刺可以通过抑制小胶质细胞中的TLR4/NF-κB信号通路来调节MCAO大鼠的炎症反应。Zhang等[29]发现，N-丁基苯酞(NBP)其通过TLR4/NF-κB抑促炎细胞因子的表达，包括IL-6、IL-1β和TNF-α，从而在阿尔茨海默病和中风动物模型中具有潜在的神经保护作用。同样的，Liu等[30-31]研究表明，抑制TLR4/NF-κB信号通路可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

6 JNK

神经细胞死亡机制的重要组成部分是激酶的混合谱系激酶(MLK)家族，其激活信号转导途径至神经元细胞死亡。MLK3是MLK家族的成员，MLK3磷酸化并激活MAPKK，包括MKK4和MKK7，其反过来激活JNK的Thr-183和Tyr-185残基，体外研究表明，MKK4可以激活JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[32]。脑卒中时神经细胞凋亡在脑I/R损伤诱导细胞死亡中起重要作用，在缺血和再灌注损伤中，自由基通过靶向多种细胞信号传导途径也在缺血性脑损伤的发病机理中起重要作用。C-JNK作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员，有助于细胞凋亡。如抑制JNK/AP-1途径显示改善新生儿缺氧缺血性脑损伤[33]。

JNK家族有3种亚型，包括JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在大多数组织中表达，JNK3选择性地存在于心脏和大脑中。磷酸化的JNK3激活核中的底物c-Jun，活性c-Jun可诱导凋亡蛋白的表达，在凋亡细胞的死亡中起关键作用。脑缺血/再灌注促进谷氨酸受体介导的JNK3信号传导途径的激活。JNK参与许多疾病的发病机制，例如中风，动脉粥样硬化，阿尔茨海默氏症和帕金森病，在炎症、细胞凋亡和坏死的信号通路中发挥重要作用，并调节缺血和再灌注过程中神经元和心肌细胞损伤中涉及的几个转录和非转录过程[33]。研究发现，JNK磷酸化和JNK依赖性通路激活在大鼠和小鼠全脑和局灶性脑缺血后发生，JNK的激活加重了中风的脑损伤，引起炎症并导致缺血性细胞死亡[34]。缺血再灌注(I/R)可显著增强海马CA1区JNK3的磷酸化，导致神经元损伤。Wen等[35]研究发现，研究表明丁基苯酞可显著增加I/R诱导的脑损伤后CA1锥体神经元的存活并抑制JNK/caspase-3信号通路发挥神经保护作用。Duan等[36]研究表明苦瓜多糖阻止了由脑内出血损伤引起的JNK3、c-Jun和caspase-3的激活，对脑内出血具有神经保护作用。

7 DAPK1

死亡相关蛋白激酶(DAPK)是一种介导细胞死亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有独特的多结构域结构，包含激酶结构域，钙调蛋白调节区段，8个锚蛋白重复序列，细胞骨架结合区域和死亡结构域，其在脑缺血后mRNA水平增加。DAPK在正常脑组织中是无活性的，其处于磷酸化状态并且伴随于体内缺血而快速且持续地去磷酸化和活化。DAPK在脑缺血后被去磷酸化并被激活。这种活化可以通过磷酸酶钙调神经磷酸酶的抑制剂FK506或原代皮层神经元中的选择性NMDA受体拮抗剂MK-801来抑制。其在神经元发育以及损伤恢复中起作用，在受影响的海马半球的上调。在发育中和成人中枢神经系统中，DAPK1 mRNA在大脑皮层和海马内的增殖区广泛表达。此外，DAPK1主要参与神经元发育和损伤恢复过程，它的活性随着缺氧缺血而增加。

细胞培养模型已证明DAPK参与神经细胞凋亡，神经元损伤后DAPK表达增加，在脑缺血动物模型中的组织损伤区域中mRNA水平增加[37]。DAPK的小分子抑制剂烷基化3-氨基-6-苯基哒嗪显著减轻缺血性中风后的脑损伤，抑制DAPK去磷酸化有助于缺血小鼠模型的神经保护作用[38]。Pei等[39]研究发现，DAPK1直接磷酸化Ser262上的Tau蛋白，导致中风后皮层神经元的脊柱损伤，小鼠中DAPK1激酶结构域(KD)的遗传缺失(DAPK1-KD(-/-))或阻断DAPK1-Tau相互作用可保护脊柱损伤并改善针对中风损伤的神经功能。

8 NLRP3炎性体蛋白

近年来对核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)的研究越来越多，包括NLRP3、NLRP1、NLRC4和AIM2。其中，NLRP3作为先天免疫中重要的模式识别受体，因参与缺血后的炎症反应而受到关注。NLRP3炎性体主要在免疫器官和免疫细胞中表达，是细胞中的多蛋白复合物，具有NLRP3、caspase-1和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)3个结构域作为核心蛋白。其主要功能是识别外源性感染和各种致病微生物内伤的风险信号，介导caspase-1的活化，将pro-IL-β加工成熟的活性形式，在细胞外分泌，从而激活天然免疫反应，导致多级炎症反应和细胞凋亡。有研究表明，过度炎症反应在脑缺血的发病机制中起着重要作用，因此，靶向炎症可能是预防和治疗脑损伤的重要治疗策略。NLRP3在受氧-葡萄糖剥夺(OGD)或模拟缺血再灌注(I/R)的原代皮层神经元中的表达。I/R损伤可以诱导脑I/R小鼠和中风患者的同侧脑组织中NLRP3炎性体蛋白，IL-1β和IL-18的表达增加。

Yu等[40]发现萝卜硫素通过抑制NLRP3炎性体激活而对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。同时，NLRP3的有效调节或抑制有助于预防或治疗缺血性中风或糖尿病。Hong等[41]用NLRP3特异性抑制剂，改善了脑缺血再灌注损伤的糖尿病小鼠。因此抑制NLRP3可以预防脑缺血再灌注损伤，NLRP3炎性体可能成为治疗缺血性中风的潜在药物靶标。

9 总结

由脑缺血再灌注引起的脑损伤死亡率在逐年上升，而脑缺血再灌注损伤是一个复杂的、多种通路参与的过程，目前用于治疗缺血性脑损伤的主要治疗方法旨在实现再灌注，神经保护和神经恢复，因此找到合适的靶点蛋白进行研究是当前国内外学者的研究热点。本文通过对近几年研究热点的靶蛋白进行综述，以期为脑缺血再灌注损伤提供系统的研究思路。