心水通胶囊水提物对慢性心衰大鼠NT-proBNP、cTNⅠ、凝血指标的影响

汪庆玲，傅珊珊，谭春江

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由于心脏功能或结构异常，导致心室充盈和(或)射血功能受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要的临床综合征。CHF是各种心脏疾病进行性发展的终末阶段，发病率死亡率居高不下，严重威胁着人类健康。

前期研究证实，心水通胶囊对CHF患者具有利水消肿、提高左室射血分数、改善心功能的作用，能提高患者生活质量，且未见毒副反应[1-3]。体外实验发现，该药物能通过改善线粒体膜电位，改善心肌细胞功能，同时提高缺氧诱导心肌细胞的存活率[1-3]。然而，该药物对CHF心肌损伤后外周血液蛋白和凝血系统的影响尚不清楚。基于此，本研究通过检测慢性心衰大鼠N-端脑利钠肽前体(NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白(cTNⅠ)、射血分数(LVEF)、凝血指标[凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)]的水平，研究该药物对这些指标的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF级Wistar雄性大鼠，120只，体重(200±10)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。动物饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级房间，温度(24±0.5)℃，湿度45%～50%，每天光照12 h，饲以标准饲料(福建中医药大学实验动物中心提供)，自由饮水；医学实验动物环境设施许可证号：SYXK(闽)2014-0005。

1.2 药品与试剂 心水通胶囊处方中药材黄芪、丹参、建泽泻等购于福建中医药大学附属第三人民医院。盐酸阿霉素(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20180525)；卡托普利(华中药业股份有限公司，批号：20170403)。

1.3 仪器与设备 小动物超声成像系统[富士胶片(中国)投资有限公司，VisualSonics Vevo 2100]；涡旋仪(IKA公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(III)型循环水式真空泵(邦西仪器科技有限公司)；石蜡切片机(Leica公司，RM2235)；生物组织石蜡包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，ZT-14S,YB-bLF)；显微镜照相系统(美国Media Cybernetics公司，DM4000B)。

2 方法

2.1 心水通胶囊中药水提物的制备 太子参、黄芪、桂枝等中药材，按处方比例称量后置于圆底烧瓶，10倍量蒸馏水室温浸泡2 h，加热提取2次，每次2 h；过滤，合并滤液，收集滤液至旋转蒸发仪，减压浓缩，最后得水提物高剂量相当于生药量浓度1.94 g·mL-1。中、低剂量由高剂量稀释，其中中剂量相当于心水通处方临床等效剂量。

2.2 造模 适应性喂养一周后，随机选取12只大鼠作为正常组，1.25 mL·kg-1注射生理盐水。其余大鼠用阿霉素1.25 mg·kg-1剂量腹腔注射造模，每周2次，连续6周。

2.3 心功能检测 造模6周后，小动物超声成像系统检测各组大鼠心功能。大鼠麻醉后胸部脱毛，置于电极板上固定，连接生理信号采集系统，选择大鼠心超探头MS-250，M-Mode测量3个心动周期的左室舒张末期内径(LVIDd)和左室收缩末期内径(LVIDs)，取均值计算左室射血分数 (LVEF)，LVEF≤50%为模型成功。

2.4 分组和给药 将心衰模型成功的大鼠随机分为模型组(M)，心水通胶囊水提液低剂量(L)4.9 g·kg-1、中剂量(B)9.8 g·kg-1、高剂量(H)19.6 g·kg-13个治疗组和卡托普利(D)2.25 mg·kg-1对照组。各组灌胃给予相应剂量的药物溶液，正常组(N)和模型组给予等容积的蒸馏水，每天1次，连续30 d。在给药15 d、30 d后分别检测各组大鼠心功能。

2.5 行为体征观察指标 观察给药期间各组大鼠毛发、大便、腹水、精神状态、活动情况、饮食、体重变化以及死亡率。参照正常组大鼠的行为活动，比较各组大鼠之间的行为体征变化情况。

2.6 血液样本采集及检测 给药后麻醉大鼠，腹主动脉取血3～5 mL，血液送检福建中医药大学附属第三人民医院，采用干式免疫荧光法检测NT-proBNP、cTNⅠ浓度，仪器法检测凝血功能相关指标。

2.7 心肌组织HE染色 采完血后打开胸腔，取出心脏，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，之后石蜡包埋、切片，脱蜡、复水，苏木精-伊红(HE)染色，树脂封片。镜下观察心肌细胞形态。

3 结果

3.1 行为体征观察 造模期间大鼠共死亡5只，造模失败3只。给药期间，正常组大鼠精神状态好，活动多，大便正常，无腹水，体重正常增长，无死亡。模型组大鼠精神状态差，饮食减少，喜欢聚团，出现腹水、便溏，皮毛黄白、松软，体重未见明显增加，死亡8只，死亡率40%；心水通低剂量组精神状态差，皮毛黄白、松软，喜欢聚团，腹水明显，体重未见明显增加，死亡7只，死亡率35%；心水通中剂量组精神状态较差，腹水较明显，体重增加较快，死亡5只，死亡率25%；心水通高剂量组精神状态较好，腹水不明显，体重增加较快，死亡2只，死亡率10%；卡托普利组活动较多，腹水较明显，体重增加较快，死亡3只，死亡率15%。提示，心水通胶囊能改善心衰大鼠精神状态、运动活力，增强体质，改善心衰预后，降低心衰大鼠死亡率。

3.2 大鼠心功能检测结果 造模完成后，与正常组大鼠相比，造模大鼠LVIDs和LVIDd增加，LVEF≤50%，提示大鼠心衰模型成功。

给药后，与模型组相比，心水通低剂量组大鼠LVIDs降低，LVEF升高(P<0.05)，LVIDd无明显变化(P>0.05)；中、高剂量组LVIDs、LVIDd明显降低，LVEF明显升高(P<0.01)。同组给药后与给药前相比，高剂量组给药30 d后LVIDs和LVIDd降低最明显，LVEF升高最明显(P<0.05)。同组给药30 d与给药15 d相比，模型组LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低(P<0.05)；而高剂量组LVIDs显著降低，且LVEF升高最明显(P<0.05)(见表1)。提示，CHF模型大鼠心功能出现进行性恶化，心水通胶囊干预后能增加心衰大鼠心肌收缩能力，提高LVEF。随着治疗逐渐延长，其中高剂量组能显著改善心衰大鼠心功能。

表1 给药前后各组大鼠心功能

注：与模型组相比，ΔP<0.05，※P<0.01；同组给药30 d、给药15 d分别与给药前相比，◎P<0.05；同组给药30 d与给药15 d相比，*P<0.05

3.3 HE染色观察心肌变化 正常组大鼠心肌纤维排列整齐，胞核椭圆、位于细胞中间，相邻细胞连接紧密，未见细胞变性、坏死；相比之下，模型组可见大鼠心肌细胞肥大，心肌纤维呈波浪形，可见部分润盘裂开，胞核移位、固缩，细胞变性、坏死，间质增宽；心水通低剂量组心肌细胞肥大程度略低于模型组，排列紊乱，胞核靠近细胞边缘，可见部分肌纤维断裂，心肌间质增宽；心水通中、高剂量组和卡托普利对照组大鼠的心肌纤维排列较致密，细胞肥大、变性、坏死程度均较模型组降低，其中高剂量组心肌改善尤为明显(见图1)。

3.4 BNP、cTNⅠ和凝血指标检测 如表2可见，模型组大鼠血清NT-proBNP、cTNⅠ和FIB浓度显著升高，PT、APTT、TT显著降低，提示心肌损伤严重，并伴有凝血功能紊乱。与模型组相比，心水通中、高剂量组NT-proBNP、cTNⅠ、FIB水平显著降低(P<0.01)，PT、APTT、TT水平显著升高(P<0.01)；低剂量组大鼠cTNⅠ、FIB水平降低(P<0.05)，APTT显著升高(P<0.01)，而NT-proBNP、PT、TT水平无显著性差异(P>0.05)。提示，心水通中、高剂量不仅改善心肌损伤和心肌功能，同时调节凝血因子，改善血流变学，这可能是该药物防治心衰的机制之一。

4 讨论

cTNⅠ属于心肌组织特有的肌钙蛋白之一，以cTnI-C-T复合物和游离态cTnI两种方式存在于心肌细胞中，机体在正常环境下血液中含量微少。当心肌细胞受损时，心肌纤维上cTNⅠ复合物分解成游离态，胞质中游离的cTNⅠ穿过细胞膜大量进入血液，使血液中cTNⅠ浓度增加。有研究表明，慢心衰时cTNⅠ浓度升高可能与心脏前负荷过重、心肌肥厚引起的细胞缺血坏死、神经内分泌系统异常激活有关[4]。NT-proBNP是由心室肌细胞分泌的一种多肽类激素，由脑钠肽前体裂解后形成。CHF时，心室腔压力、容量负荷增加，心室壁扩张和牵拉增大，钠尿肽系统激活，引起NT-proBNP合成增加并进入血液，使血液NT-proBNP浓度异常升高[5]。研究发现，血清cTNⅠ和NT-proBNP浓度水平与心脏LVEF呈负相关，其浓度随心肌损伤程度、心衰程度的加重而升高，两者对于评估慢心衰患者的心功能、治疗及预后具有重要意义[6-7]。CHF患者心功能改善时，血清cTNⅠ和NT-proBNP浓度水平也同时降低。

表2 给药30 d后各组大鼠NT-proBNP、cTNⅠ、凝血功能指标变化

注：与模型组相比，ΔP<0.05，※P<0.01

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果(40×)

CHF时血流动力学异常、凝血因子激活，血液呈现出高凝状态，约1/3患者易出现较严重并发症血栓[8]。研究发现，凝血指标异常导致的血栓事件与心脏功能恶化相关[9]。心衰患者的高凝血状态，是增加其死亡率的独立危险因素，临床中抗凝血治疗、预防血栓形成，不仅能改善患者预后，还可以降低死亡率[8]。凝血四项指标中，PT、APTT分别是外源性、内源性凝血系统中常用监测指标，反映了凝血因子的不同水平。FIB是一种血浆蛋白，CHF时血管内皮受损、组织因子释放等，可促进血液FIB浓度升高，诱发机体血液高凝状态，从而增加血液黏度和血小板的聚集[10]，FIB水平升高，是心衰危险的独立预测指标。TT值与血液中的肝素或类肝素物质浓度水平有关，可观察血中凝血因子抗凝物质是否增多。

CHF患者多因心阳不振或心气不足，血行不畅，瘀血内停，心阳虚为本，血瘀水停为标，属本虚标实之证。心水通胶囊由黄芪、太子参、丹参和建泽泻等组成，具有益气温阳利水，活血祛瘀，心肾同治之功。从超声心动图结果可以看出，心水通胶囊中药水提物，能剂量依赖性减低左室LVIDs和LVIDd，同时提高LVEF，说明该药物能减少心室腔压力和容量负荷张力；从心肌HE病理图片发现，心水通胶囊中药水提物中、高剂量能降低CHF大鼠心肌细胞肥大、变性、坏死，其中高剂量最能明显改善阿霉素引起的心肌损伤，与心水通胶囊剂量依赖性降低CHF大鼠血液NT-proBNP、cTNⅠ浓度的结果一致。心功能、病理切片、血清NT-proBNP和cTNⅠ水平等结果，说明该药物能降低阿霉素对心肌的毒性作用，修复重塑心肌，提高心脏射血，改善心功能。从凝血指标的检测结果发现，心水通胶囊水提物能显著降低心衰大鼠血液FIB浓度，提高PT、APTT、TT水平，且作用强度呈剂量依赖性增加。提示，心水通胶囊能改善心衰大鼠的高凝血状态。

因此，基于以上理论，以及综合此次实验的心功能、血液指标、病理切片结果分析，心水通胶囊一方面直接作用于心肌细胞，修复损伤心肌，改善心肌功能，另一方面可能通过改善CHF凝血而改善心功能，两者相结合，共同提高CHF大鼠生存质量，并改善预后，降低死亡率，这与观察到的大鼠行为体征结果相一致。前期体外实验研究发现，心水通胶囊能通过稳定线粒体和溶酶体膜电位来提高缺氧诱导心肌细胞的存活率[11]。由于凝血机制涉及多个环节[12]，该药物可能多途径多靶点作用于凝血系统相关的酶、蛋白、受体和因子，抑制血小板聚集途径和凝血途径，从而达到改善心衰大鼠体内高凝血状态的治疗作用，但该药物对于CHF凝血系统的具体作用位点和机制有待以后进一步研究。