苦参碱自微乳体外抗肿瘤活性研究

郭明兴，苏婷婷，傅春升

(1.山东省卫生健康委员会医疗管理服务中心，山东 济南 250014；2.济南市中西医结合医院，山东 济南 250014；3.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

肝癌严重危害着人类健康,是我国常见的恶性肿瘤之一。根据流行病学资料,我国肝癌的发病率和死亡率占全部恶性肿瘤的第二位,仅次于肺癌[1-2]。苦参碱能够抑制鼠移植性肝肿瘤[3-6]，但是苦参碱存在普通剂型溶出速度慢，吸收较差等缺陷[7]。自微乳化给药系统在37 ℃环境下，通过温和搅拌即可自发乳化成粒径小于100 nm的微乳[8]。本研究制备苦参碱自微乳和原料药含药血清，比较不同含药血清对肿瘤细胞的抑制、杀伤作用，为苦参碱自微乳治疗肝癌提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 CKX-31倒置显微镜(Olympus公司)；BIOBASE-EL10A型全自动酶标仪(山东博科)；CO2培养箱(上海胜卫电子科技有限公司)；离心机(奥豪斯国际贸易有限公司)。

1.2 试药 苦参碱自微乳(自制，含药量为4.76%)；苦参碱(中国药品生物制品检定所，批号：110805-200306)；RPMI-1640培养基；胎牛血清；噻唑蓝(MTT)；96孔板；二甲基亚砜(DMSO，批号：201301013，MP Biomedicals公司)。

1.3 肿瘤细胞株和研究对象 HepG2细胞；Wistar大鼠，由济南朋悦实验动物繁殖有限公司提供，体重(220±30)g，动物许可证号：SCXK(鲁)20140007。

2 方法

2.1 苦参碱自微乳的制备 自微乳处方：苦参碱∶油酸∶油酸乙酯∶EL-40∶异丙醇=0.5∶1.5∶1.5∶3.5∶3.5。称取处方量的油酸、油酸乙酯、EL-40、异丙醇，加入到50 mL烧杯中，涡旋混匀至无分层，得空白自微乳液；将处方量的苦参碱加入到空白微乳溶液中，将烧杯置于磁力搅拌器上，转速100 rpm，搅拌10 min制得苦参碱自微乳液。

2.2 含药血清的制备 Wistar大鼠分空白组、自微乳组、原料药组，每组8只，按含药量60 mg·kg-1剂量灌胃，空白组给予相同体积的蒸馏水，早晚各1次，灌胃21 d，禁食1 d，第22天给药2 h后，麻醉大鼠，下腔静脉取血，收集上清，过滤除菌，低温保存。

2.3 MTT实验 用对数期细胞制备悬液，调整密度为5×104/mL，吹打均匀。96孔板铺板，每孔加入100 μL细胞悬液，四周每孔加入200 μL PBS，置于CO2培养箱18 h。设置自微乳组、原料药组、阴性对照组、空白组，每组铺6孔。细胞贴壁，弃去培养液，加入含药血清干预，于CO2培养箱培养24 h和48 h。每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，培养4 h，弃去培养液，加入150 μL DMSO，恒温摇床8 min，上机测定吸光值。

2.4 凋亡率测定 设置30%自微乳组、20%自微乳组、30%原料药组、20%原料药组、对照组(不加含药物血清)5组细胞，培养24 h，处理细胞，收集所有悬浮细胞和贴壁细胞，离心机离心，沉淀物重悬计数。加入5 μL AnnexinV-FITC、10 μL碘化丙啶染色液混匀，加MTT溶液10 μL，培养4 h。弃掉培养液，每孔加150 μL DMSO。室温避光孵育15 min，上机检测。

2.5 细胞周期检测 对数期细胞过夜贴壁。弃掉旧培养液，加入20%原料药血清，30%原料药血清，20%自微乳血清，30%自微乳血清，设对照组，24 h后收集所有细胞。调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL单细胞悬液。离心，沉淀物用70%乙醇固定，4 ℃保存。加入100 μL RNaseA，37 ℃水浴35 min，400 μL PI染色均匀，4 ℃避光35 min后测定数值。

3 结果

3.1 运用MTT法检测得的OD值，计算自微乳与原料药对肝癌HepG2细胞的抑制率，不同血药浓度血清对肝癌HepG2细胞的影响见表1。

表1 不同浓度含药血清对肝癌HepG2细胞的影响

注：相同时间点、相同浓度两组比较，*P<0.05,**P<0.01

结果，自微乳组与原料药组对肝癌HepG2细胞的抑制作用有明显差异。干预24 h，20%含药血清处理细胞，自微乳组的抑制率明显大于原料药组；30%含药血清处理细胞，自微乳组的抑制率明显大于原料药组。干预24 h，20%含药血清处理细胞，自微乳组的抑制率明显大于原料药组；30%含药血清处理细胞，自微乳组的抑制率明显大于原料药组。

3.2 苦参碱含药血清对HepG2细胞的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖性(见图1)。

图1 体外抑瘤活性曲线

3.3 凋亡率结果 20%自微乳含药血清、30%自微乳含药血清干预HepG2细胞的凋亡率为47.53%、72.19%。20%原料药含药血清、30%原料药含药血清干预HepG2细胞的凋亡率为31.97%、42.19%。

3.4 流式细胞术检测细胞周期结果 20%自微乳含药血清、30%自微乳含药血清干预HepG2细胞，S期所占比例为15.17%、19.10%。20%原料药含药血清、30%原料药含药血清干预HepG2细胞，S期所占比例为11.42%、13.11%。

图2 含药血清诱导HepG2细胞凋亡

图3 含药血清干扰细胞周期

4 讨论

张思维等[9]分析数据发现肝癌仅次于肺癌为中国肿瘤登记地区死亡率第二位的癌症类型。随着对苦参碱及其制剂研究的不断深入，苦参碱药理作用逐渐被发现，其用于治疗肝损伤、肝纤维化、肝癌的疗效深受医药工作者重视[10]。金艳书等[5]研究发现，苦参碱能够诱导人肝癌细胞凋亡，影响人肝癌细胞周期。细胞凋亡是机体对异常细胞或衰老细胞的有效清除手段[11]。

本研究采用MTT法检测细胞活力，结果表明：自微乳含药血清对细胞的抑制作用与原料药含药血清对细胞的抑制作用差异明显。含药血清作用于细胞的时间越长或含药血清的浓度越大，其对细胞增殖的抑制作用越大。细胞凋亡率检测结果表明，相同血清浓度下，自微乳含药血清组诱导细胞凋亡的能力明显高于原料药含药血清组，且随着含药血清浓度的增大，其细胞凋亡率越高。通过自微乳组和原料药组对细胞周期影响的研究表明，自微乳组的作用显著高于原料药组。将苦参碱制备成自微乳化制剂能够改善苦参碱难溶于水，吸收困难的缺点，明显提高其在体内的吸收利用率。因此，将苦参碱制备成自微乳化制剂有利于提高苦参碱的生物利用度，为苦参碱自微乳治疗肝癌提供理论依据。