血清学异常糖链糖蛋白(TAP)在鼻咽癌中临床分期中的诊断价值

李智琼 孙承谋 朱玲娜 孔昌盛 喻葵

(1.宜昌市夷陵医院检验科，湖北 宜昌 443100；2.荆门市第一人民医院院感科，湖北 荆门 448000)

鼻咽癌(NPC)是头颈部常见的恶性肿瘤，具有独特的地域和生物学特性，它在中国南方，东南亚流行。单发或多发颈部淋巴结肿大是其常见的临床症状。鼻咽癌是一种高度放射敏感的肿瘤。放射疗法是NPC主要治疗手段；早期鼻咽癌总体生存率约为90%，70%患者初治时多为局部晚期或合并多出转移，5年生存率通常较差。对于鼻咽癌的诊断和筛查包括了鼻咽镜镜检和血浆中EBV-DNA检测检查。对于大多数非肿瘤专科医院，特别是中西部偏远地区基层医院中，EBV-DNA检测，鼻咽镜等难以推广。因此，选择鼻咽癌早期筛查和诊断的肿瘤标志物具有重要的意义。肿瘤异常糖蛋白(TAP)，又称异常糖链糖蛋白，在肿瘤的即可释放到组织液和体液中，当机体中肿瘤细胞达到1×108时，即可在末梢血液中检测出；具有检测方便、快速、无创等优点。TAP的检测在临床甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌中已报告具有重要的临床价值，在鼻咽癌中的报道尚不清楚。本文分析并比较TAP和EBV-DNA在正常患者和鼻咽癌定量检测差异，并探讨其在鼻咽癌临床分期的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集宜昌市夷陵医院院2010年1月至2017年12月140例患者作为观察组，年龄23～75岁；男84例，女56例。所有患者按照第八版AJCC分级分期标准和世界卫生组织2002标准进行分型 。其病理类型主要包括：角化型鳞状细胞癌 23例(16.42%)，非角化型癌 99例(70.71%)，基底细胞鳞状细胞癌 18例(12.67%)。TNM分期类型：140例患者中Ⅰ期5例(3.57%)，Ⅱ期19例(13.57%)，Ⅲ期83例(59.29%)，Ⅳ期33例(23.57%)。T1 7例，T2 76例，T3期 33例，T4期 24例；N0期 3例，N1期 44例，N2期 68例，N3期 25例；M0期 128例，M1期12例。同期选取本院健康体检人群120名作为对照组，年龄2～65岁，其中男76名，女44名。本实验得到医院伦理委员会批准和受检者的知情同意。

1.2仪器与试剂 EBV-DNA 检测试剂盒购自广东华银医药科技有限公司，采用TapMan荧光探针基因聚合酶链式反应(PCR)扩增法，检测方法参考试剂说明书。TAP检测试剂盒(凝集法)及瑞生TAP检测图文系统标准版购自浙江瑞生医疗科技有限公司。

1.3方法 (1)DNA提取：分别取实验组和对照组静脉血2 mL，全血经4℃ 12 000 r/min离心10 min后弃上清液，加入DNA提取液并混匀，置于恒温水浴箱中热处理10 min(100 ℃)；静置于冰盒中5 min，再次离心10 min，-20 ℃保存备用。(2)EBV-DNA检测：EBV-DNA定量测定采用荧光定量PCR法。荧光定量PCR扩增引物序列：F-5'-CGTAGATGGCCATATTTCAG-3; R-5-GTTTCTA-GCTGTAGTCACTCG-3。双末端标记荧光探针5-(FAM)TACCACCGTCCGGAGA ATGC(TAMRA)-3。反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件：95 ℃ 15 min，94℃ 2 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，4 ℃ 30 min，共35个循环。阳性定量标准品以EBV- DNA BamHI-W片段作为阳性模板，EBV-DNA水平大于1×10 copy/mL判断为阳性，EBV- DNA水平小于或等于1×10 copy/mL判断为阴性[5]。(3)TAP检测：实验组和对照组待检者采集末梢血，规范手法挤血、采血。实验组患者均为初诊患者，采血前均未进行放疗、化疗、靶向治疗、中药抗肿瘤治疗及其他物理肿瘤治疗。每张玻片采血量20～30 μL，共制作2张。血片干燥后滴加TAP检测试剂3滴(每滴约50 μL，液滴斑点直径10～15 mm)，轻微摇晃保证使检测剂均匀分布，常温下静置3 h使其充分反应，血片形成圆形斑点提示显色完成。TAP凝聚物是不规则的类圆形晶体颗粒，有晶体颗粒检出为阳性，若无晶体颗粒检出为阴性。此晶体颗粒因聚集的多少又可以呈现出不同的颜色，周围混合物较多则呈现棕黑色或墨绿色，反之则呈现淡绿色、棕色或者淡黄色。将有可疑的斑点图像转用40×物镜观察，在瑞生TAP检测图文系统中采集>80 mm以上的特异凝集物为有效凝集颗粒，如果有效凝集颗粒数量为1颗，则检测特异凝集物的结果为该颗粒实际面积大小；若有效凝集颗粒大于等于2颗，则检测特异凝集物的最终数值就等于所有颗粒面积总和×0.62。TAP凝聚物结果：凝集物≥121～225 mm；提示TAP异常为阳性结果；凝集物<121 mm，则提示TAP正常为阴性结果。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析处理。血清TAP阳性率和血浆EBV-DNA拷贝数阳性率采用非参数检验方法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组检测结果 实验组血清TAP的阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 血浆EBV-DNA阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。血清TAP的阳性率略高于血浆EBV-DNA阳性率，但二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组血清TAP和血浆EBV-DNA阳性率比较(%)

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.2各组病理学检测结果 在角化型鳞状细胞癌和基底细胞鳞状细胞癌组中，血清TAP的阳性率和血浆EBV-DNA阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。在非角化型癌组中，血清TAP的阳性率与血浆EBV-DNA阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 血清TAP和血浆EBV-DNA在鼻咽癌不同病理分期中阳性率比较[n(%)]

2.3血清TAP阳性率与鼻咽癌患者TNM分期的关系 随着T分期、N分期、M分期的递增，肿瘤患者血清TAP的阳性率逐步增加，在T1、T2期、N0、N1期中，血清TAP与血浆EBV-DNA阳性率的差异具有统计学意义。见表3、表4、表5。

表3 鼻咽癌患者不同T分期血清TAP和血浆EBV-DNA阳性率比较[n(%)]

表4 鼻咽癌患者不同N分期血清TAP和血浆EBV-DNA阳性率比较[n(%)]

表5 鼻咽癌患者不同M分期血清TAP和血浆EBV-DNA阳性率比较[n(%)]

2.4血清TAP阳性率与鼻咽癌患者临床分级的关系 随着分级的递增，肿瘤患者血清TAP的阳性率逐步增加，在Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌中，血清TAP与血浆EBV-DNA阳性率的差异具有统计学意义(P<0.05)；在Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌中，血清TAP与血浆EBV-DNA阳性率的差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 不同肿瘤分级中血清TAP和血浆EBV-DNA阳性率比较[n(%)]

3 结 论

鼻咽癌是EB病毒感染相关的恶性肿瘤，目前临床EB病毒感染的检测主要包括了EBV相关的血清标记物，如VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNase和血浆EBV-DNA定量测定。这类方法的应用具有一定的局限性：(1)不适合基层医院的广泛推广；(2)对于鼻咽癌低发区域的鼻咽癌(非EB病毒感染相关鼻咽癌)早期诊断临床价值欠佳。寻找其他肿瘤来源的标记物具有重要的临床意义。致癌因子的刺激促进了原癌基因和抗癌基因的异常表达，从而导致癌症的发生[6]。当致癌因子影响细胞核时，钙组蛋白从DNA链中分离并释放到血液中，因此，裸露的DNA容易受损，导致癌细胞的发生；另一种是糖链异常的糖蛋白，存在于细胞膜中，它是由突变基因产生的具有异常功能的糖蛋白[7]。TAP是异常糖蛋白、钙组蛋白和基因在细胞癌变后表达的常见复合物。TAP检测是一种借助于凝固剂的特异性检测技术，通过凝固剂有助于肿瘤异常蛋白的聚集和特异性结晶颗粒的形成，且不含TAP物质的人血标本不能形成结晶。

近年来，随着国内外研究的不断深入，已发现肝癌、乳腺癌、食管癌等上皮来源恶性肿瘤中TAP也呈高表达。有研究[8]结果显示，TAP在肝脏肿瘤具有较高表达，阳性率为70.0%～95.0%；在消化系统肿瘤高危人群的筛查中，TAP阳性检测特异度为97.7 % ，误诊率为2.3%；将其作为肝癌血清学检测重要指标，对发现肝癌癌前病变有较高的灵敏度和特异性。临床中，肿瘤标志物已应用于肿瘤的术前分期、术后疗效监测和复发的早期诊断。而在肿瘤侵袭转移过程中，血清唾液酸含量在临床影像诊断前数周升高，这对于早期发现和及时治疗非常重要[9-10]。

本资料中，鼻咽癌患者血清TAP阳性率与T分期显著相关，肿瘤T分期越高，血清TAP阳性率越高，T3期、T4 期患者血清TAP阳性率高于T2期和T1期患者，其机制为肿瘤分期越晚，释放到体液和血液中的TAP越多，因此，其能够间接反映肿瘤的复制程度。本实验中鼻咽癌患者血清TAP阳性率与N分期有显著相关性，随着N分期的增加，患者血清TAP释放越多，N0期血清TAP表达最低，N3期血清TAP表达最高。同时本实验结果显示，鼻咽癌患者血清TAP表达与M分期也密切相关，M1期血清TAP阳性率高于M0期，其机制可能是血清TAP与转移的肿瘤负荷有关，血清TAP可能由肿瘤细胞释放进入外周血，随着病情的进展，血清TAP表达会相应增加。

本实验比较血清TAP与血浆EBV-DNA两种检测方法对鼻咽癌的诊断价值，结果显示，对于Ⅰ和Ⅱ期患者，血清TAP具有高敏感性，同时在非EB病毒感染的鼻咽癌病理类型(角化型鳞状细胞癌)中，血清TAP具有更高的敏感性(P<0.05)。对于Ⅲ期和Ⅳ期患者，血清TAP的高敏感性低于血浆EBV-DNA。与文献报道TAP对早期肿瘤的诊断具有重要的临床意义相一致。

综上所述，对于广大基层医院，血清TAP检测对早期鼻咽癌的筛查，具有效果好、价格便宜、准确率高和简便易行等优点，值得临床推广应用。