槲皮素对K562细胞增殖和凋亡的影响

潘莉萍 袁伟

（武汉大学基础医学院，湖北武汉430072）

慢性骨髓性白血病（CML）发病率高，预后差，死亡率高，寻找新的治疗方案是各国学者关注的重点［1］。槲皮素是一种常见类黄酮物质，最近研究发现其具有广泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗肿瘤等［2－4］。本研究以人慢性髓系白血病细胞K562为靶细胞，探讨槲皮素对慢性髓系白血病细胞K562的作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 K562（购自武汉病毒研究所）槲皮素（sigma，美国），RPMI 1640培养基（Gibgo，美国）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培养板（Falcon，美国）；β－actin抗体（Abmart，中国），p－JAK2抗体（CST，美国），JAK2抗体（CST，美国）p－STAT3抗体（CST，美国），STAT3抗体（CST，美国）。TRIzol reagent（Invitrogen，美国），逆转录试剂盒（GeneCopoeia，美国），SYBRgreen（Takara，日本），Q－PCR仪（BIO－RAD，美国），蛋白裂解液RIPA（碧云天，中国），蛋白酶抑制剂cocktail及Western blot凝胶制备试剂盒购自武汉谷歌生物公司，BCA蛋白定量试剂盒（上海碧天生物技术有限公司），qPCR引物（北京擎科生物技术有限公司），酶标仪（Thermo Fisher，美国）。

1.2 实验方法 （1）细胞培养：K562细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，加入青霉素（100U／mL）和链霉素（100U／mL），在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。（2）K562细胞增殖的MTT法检测：取对数生长期K562细胞，接种于12孔板内，调整密度为2×105／mL，每孔90μL，分别加入槲皮素（0，10，20μmoL），另设空白孔组（只加培养基，不加药物），每组设3个复孔。12孔板置于37℃、5%CO2培养48h，每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，然后加入三联裂解液［10%SDS＋5%异丁醇＋1%HCL（10mol／L）］，100μL，37℃放置过夜后，用酶标仪于波长570nm处读取吸光度（OD）值，根据OD值计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－实验组OD值／空白组OD值）×100%。（3）Annexin－V／PI双染法检测细胞凋亡：取对数生长期的K562细胞以1×105／mL接种于96孔板内。细胞培养48h后，加入槲皮素（0，10，20）μg／mL，取1mL细胞悬液，1 000r／min离心5min，弃培养基，加RNA酶，37℃水浴1h，放入冰浴加入0.5mg／L碘化丙啶（PI）及Annexin V，流式细胞仪检测CELIQU－，EST软件分析细胞凋亡率。（4）Western blotting检测槲皮素对K562细胞JAK2、STAT 3，p－JAK2，p－STAT 3，Bax和Bcl－2表达：按照蛋白裂解液RIPA操作说明提取各组蛋白，BCA法进行蛋白定量。取各组细胞总蛋白样品40μg，以β－actin为内参，经SDS－PAGE凝胶电泳、转膜，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2h，分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释JAK2抗体（1∶1 000）、p－JAK2（1∶500）、STAT 3（1∶1 000）、p－STAT 3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl－2（1∶1 000）、β－actin（1∶3 000）抗体，4℃孵育过夜。PBS洗膜3次，10min／次，根据一抗的来源，再分别加入含2%脱脂奶粉的PBS稀释的HRP，标记羊抗兔IgG（1∶500），HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5 000），室温下作用2h，PBS洗膜3次，10min／次，ECL化学发光显色、压片、显影、定影、胶片扫描保存。用Ge－l Pro Analy zer（Ver.3.0）软件测定蛋白条带灰度值，JAK2、p－JAK2、STAT 3、p－STAT 3条带灰度值与β－actin内参条带灰度值的比值分别将上述蛋白表达量化。（5）实时定量PCR（RT－PCR）检测Bax和Bcl－2：按照总RNA提取试剂盒（takara）说明提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测量浓度（thermo fisher），逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书（takara）进行，，实时定量PCR（Bio－Rad）。引物均由invitrogen公司合成。管家基因β－actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2－ΔΔCT计算相对表达量。引物序列，见表1。

表1 实时定量PCR检测的引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件包进行分析，实验结果采用mean±S.D表示，资料采用单因素方差分析（ANOVA），多个样本之间的两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素抑制K562细胞增殖 MTT检测实验结果显示，抑制K562细胞增殖（P＜0.05）作用呈浓度依赖性，最佳抑制浓度为20μmol／L。见图1。

图1 MTT检测槲皮素对K562细胞增殖的影响

2.2 槲皮素诱导K562细胞凋亡 实验结果显示，槲皮素诱导K562细胞凋亡作用呈浓度依赖性，最佳浓度为20μmol／L，P＜0.05见图2。

图2 槲皮素对各组K562细胞凋亡的影响（＊P＜0.05）

2.3 槲皮素对K562细胞Bax、Bcl－2mRNA表达的影响 实验结果显示槲皮素呈浓度依赖性促进Bax mRNA表达增加（＊P＜0.05）而降低Bcl－2mRNA表达（＊P＜0.05）。见图3。

图3 RT－PCR检测槲皮素对K562细胞Bax、Bcl－2mRNA表达的影响（＊P＜0.05）

2.4 槲皮素对K562细胞JAK2、STAT3蛋白表达的影响 实验结果显示：经槲皮素作用K562细胞48h后，JAK2、STAT3蛋白浓度无明显变化（P＞ 0.05），p－JAK2、p－STAT3浓度明显降低（△P＜0.05），见图4。

图4 Western blotting检测槲皮素对K562细胞JAK2、STAT3蛋白表达的影响

2.5 槲皮素对K562细胞Bax、Bcl－2蛋白表达的影响 实验结果显示，经槲皮素作用K562细胞48h后，Bax表达明显增高（△P＜0.05），而Bcl－2表达明显降低（1P＜0.05）。见图5。

图5 Western blotting检测槲皮素对K562细胞BCL－2、Bax蛋白表达的影响（1 P＜0.05）

3 讨 论

目前对CML大多仍采用传统的化疗和干细胞移植，但化疗对肝脏和肾脏很大损害，且复发率高［1］。而干细胞移植受制于干细胞的紧缺和现有条件，难以大规模开展。祖国医学博大精深，因此从祖国医学宝库中挖掘抑制白血病细胞恶性增殖的方法是研发高效低毒的抗肺癌药物的有效途径之一［1］。槲皮素是一种广泛存在于植物的花、叶、果实中的一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3’，4’，5，7－五羟基黄酮，具有多种生物学活性，如抗炎、抗凋亡、抗氧化应激以及抗肿瘤的活性，因此具有很高的药用价值［5］。最近研究发现槲皮素具有明显的抗肿瘤活性作用，可抑制肝癌、乳腺癌和胃癌等［2－6］。而槲皮素对血液系统肿瘤之一的CML的作用及其机制尚不清楚。

实验中我们通过MTT和流式检测发现槲皮素可以呈浓度依赖性诱导白血病细胞K562增殖抑制和促进K562细胞凋亡，以及促进凋亡蛋白Bax明显增高，抗凋亡蛋白Bcl－2明显降低，上调Bax／Bcl－2比例。因此我们推测槲皮素具有抑制K562细胞增殖和促进K562凋亡的作用而具有抗白血病肿瘤的活性，但具体机制不明。

JAK2／STAT3信号途径是在多种细胞发挥介导作用的信号通路，具有调节炎症、凋亡、增殖等功效的。目前研究发现JAK2／STAT3信号通路在K562细胞增殖扮演重要作用［7］。实验结果显示槲皮素可以呈浓度依赖性降低p－JAK2和p－STAT3的表达，而对JAK2和STAT3表达无明显影响，因此我们推测槲皮素是通过降低JAK2和STAT3信号蛋白磷酸化结构修饰，而非调节JAK2和STAT3的表达量而抑制JAK2／STAT3信号通路的激活。

综上所述，我们推测槲皮素可通过抑制JAK2／STAT3信号通路激活而抑制K562细胞增殖和促进K562凋亡。但槲皮素是直接作用于JAK2信号分子还是通过调节其上游激酶和信号分子而间接发挥作用仍不清楚，尚需进行更深入的研究。

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［4］ 刘易蓉，梁光义，张永萍.小花清风藤中槲皮素的提取工艺研究［J］.贵州医药，2006，30（6）：566－567.

［5］ Avci CB，Yilmaz S，Dogan ZO，et al.Quercetin－induced apoptosis involves increased hTERT enzyme activity of leukemic cells［J］.Hematology，2011，16（5）：303－307.

［6］ Brisdelli F，Bennato F，Bozzi A，et al.ELF－MF attenuates quercetin－induced apoptosis in K562cells through modulating the expression of Bcl－2family proteins［J］.Mol Cell Biochem，2014，397（1）：33－43.

［7］ Zhu JF，Li ZJ，Zhang，et al.Icaritin shows potent antileukemia activity on chronic myeloid leukemia in vitro and in vivo by regulating MAPK／ERK／JNK and JAK2／STAT3／AKT signalings［J］.PLoS One，2011，6（8）：720－722.