贵阳地区儿童幽门螺杆菌临床分离菌株毒力基因cagA和vacA的表达情况以及与抗生素耐药之间的关系

秦丹 朱莉 龙梅 熊妍 刘文莉 全小丽

（1.贵阳医学院研究生院儿科，贵州 贵阳550004；2.贵阳市儿童医院，贵州 贵阳550003）

幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori，Hp）是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。儿童体内Hp菌的cagA基因和vacA基因的研究还未见报道，因此本研究对于贵阳地区儿童HP临床分离菌株的基因型进行研究。Hp的根除治疗目前主要用的是标准三联疗法，耐药菌株的产生是Hp根除治疗失败的主要原因。而关于毒力基因与耐药之间的关系，目前国内关于儿童的研究报道较少，故本实验将对两者的关系进行分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2013年5月至2014年7月因上消化道症状于贵阳市儿童医院行胃镜检查的患儿。选取快速尿素酶试验阳性的患儿的胃窦粘膜标本，共283例，培养出31例，年龄3～14岁，男22例，女9例，平均年龄8.13±2.86岁。所有患儿4周内未使用抗生素、铋剂及质子泵抑制剂。标准菌株NCTC11637由贵阳医学院微生物教研室提供。

1.2 主要器材与试剂

幽门螺杆菌选择性添加剂（OXOID，英国），微需氧产气袋（Mitsubishi，Japan），甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星药品粉末均购于中国药品生物制品检定所。细菌DNA提取试剂盒购于北京天根生公司，16srRNA引物及cagA和vacA基因亚型引物参照文献由生工生物工程（上海）股份有限公司 合 成，cagA［1］的 上 游 GATAACAGGCAAGCTTTTGAG，下游 CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA。VacA各基因亚型的序列分别为slars，上 游 GTCAGCATCACACCGCAAC 下 游CTGCTTGAATGCGCCAAAC，slb上游 AGCGCCATACCGCAAGAG 下 游 CTGCTTGAATGCGCCAAAC，slcCTCGCTTTAGTGGGGCTA下游CTGCTTGAATGCG CCAAA，ml上游GGTCAAAATGCGGTCATGG下游CCATTGGTACCTGTAG AAAC，m2 上 游 GGAGCCCCAGGAAACATTG下 游 CATMCTAGCGCCTTGCAC［2］。

1.3 试验方法

1.3.1 标本的培养与鉴定 剪将胃窦粘膜组织剪碎后将组织浆液接种在哥伦比亚培养基上以后置于微需氧环境37℃ 培养3～5d，挑选针尖大小透明水滴样可疑幽门螺杆菌菌落进行革兰氏染色，并且提取DNA进行16s鉴定。具体方法参照《贵州省幽门螺杆菌临床菌株的分离培养》［3］。

1.3.2 PCR检测毒力基因cagA及vacA基因亚型cagA基因的PCR，反应体系为2×Taq PCR Master－Mix 12.5ul，上下游引物各0.6ul，模板 DNA0.8ul，余下用双蒸水（ddH2O）补足至25ul。反应条件：94℃ 预变性5min；94℃变性30s，53℃复性30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃保温5min。s1a，m1和m2的反应条件和体系相同：反应体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5ul，上下游引物各0.6ul，模板DNA1ul，余下用双蒸水（ddH2O）补足至25ul。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性20s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。s1b和s1c反应体系为2×Taq PCR Master－Mix 12.5ul，上下游引物各1ul，模板 DNA2ul，余下用双蒸水（ddH2O）补足至25ul。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃保温5min。所有反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳后G：BOX凝胶成像系统拍照鉴定。

1.3.3 抗生素耐药率的测定 采用琼脂稀释法，配置不同药物及药物浓度的含血MH培养基，微需氧条件下37℃培养3天，结果参照NCCLS标准鉴定。阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星 MIC≥1μg／mL，甲硝唑 MIC≥32μg／ml判定为耐药菌株。以标准菌株NC11637作为质控菌株。每次试验均设不含药的平板作为阴性对照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 cagA基因及vacA基因亚型PCR结果 从31株幽门螺杆菌菌株中，共有26例菌株含cagA基因，阳性率为83.87%。vacA各基因亚型的检出率分别为：s1a（22／31，70.97%），s1c（6／31，19.35%），m1（4／31，12.90%），m2（19／31，61.29%），31株幽门螺杆菌中未检测到s1b亚型。vacA基因亚型s1a，s1b，s1c，m1和 m2的检出率分别为83.87%（22／31），0% （0／31），19.35%（6／31），12.90%（4／31）和74.19%（19／31）。各组合的检出率为：s1a／m2型48.39%（15／31），s1a／m1型6.45%（2／31），s1a＋s1c／m2的12.90%（4／31），s1a型12.90%（4／31），s1c／m2 型6.45%（2／31），m1型3.23%（1／31），m2型6.45%（2／31），有1例同时有 m1和 m2型。各基因的凝胶电泳结果见图1至图5。

图1 cagA基因电泳图

图2 vacA基因亚型s1a电泳图

图3 vacA基因亚型s1c电泳图

图4 vacA基因亚型m1电泳图

图5 vacA基因亚型m2电泳图

2.2 耐药情况 贵阳地区儿童幽门螺杆菌对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐药率分别为16.13%（5／31）、19.35%（6／31）、41.94% （13／31）和12.90%（4／31）未发现多重耐药菌株。甲硝锉的耐药率大于阿莫西林（P＜0.05）和左氧氟沙星（P＜0.05），其他抗生素耐药性之间差异无统计学意义，见表1。。

表1 贵阳地区儿童幽门螺杆菌不同抗生素耐药率

2.3 毒力基因与抗生素的耐药性 用Fischer确切概率分析cagA基因与各种抗生素耐药性之间的关系，未发现其与阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑及左氧氟沙星耐药性之间有相关性（P＞0.05）。毒力基因与抗生素之间无相关性（P＞0.05）。

3 讨 论

幽门螺杆菌的不同的基因会引起不同的临床转归，有学者根据cagA的有无及vacA的基因型，将幽门螺杆菌分为两类，Ⅰ型菌株主要为cagA＋／s1m1vacA，感染后与溃疡和癌症有关，Ⅱ型菌株为cagA－／s2m2vacA，通常表现为无症状胃炎。cagA基因可表达CagA蛋白，因此，cagA可作为Hp毒力强弱的标志，CagA阳性的为高毒力菌株。西方国家约50～70%的幽门螺旋杆菌是cagA阳性的菌株。本实验的结果提示cagA的阳性率为83.87%，说明本地区的感染以cagA＋为主，表明毒力较强。vacA基因有着很明显的地域差异性，不同的基因分型的毒力也不相同，以s1a／m1毒力最强，s2／m2毒力最弱。不同的国家和地区的分布不同，VacA亚型在北欧和东欧以s1a型为主。北美及中南欧S1a和S1b大致相等。中南美S1b为主，日本S1a为主，m1和m2世界各地分布大致相同。在本实验中，vacAs1a阳性率为70.97%，vacAsm2的阳性率为61.29%，而s1am2基因型的检出率为35.48%，高于其他基因组合，表明本地区的儿童幽门螺杆菌感染vacA基因亚型以s1am2为主，与该地区成人的检出结果相同［4］。实验结果还提示，有1株细菌同时有m1和m2亚型，而这两种亚型不可能同时出现在一种Hp菌株中，提示可能为混合感染。

实验针对本地区的儿童幽门螺杆菌临床分离菌株进行阿莫西林、克拉霉素，甲硝唑，左氧氟沙星的耐药性进行检测，均发现了耐药菌株。目前对于耐药性的产生多在分子研究上。幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性的产生与23SrRNA V区DNA序列突变关系密切［5］。Kwon等研究表明Hp对甲硝唑耐药性与编码参与甲硝唑氧化还原反应酶的rdxA基因突变有关，由于基因突变导致酶表达的缺失或者酶的活性降低，从而不能有效地将甲硝唑还原成有细胞毒性的还原产物，最终导致Hp对甲硝唑耐药［6］。阿莫西林的耐药还较为少见。有研究显示其耐药的产生与青霉素结合蛋白－1（PBPs－1）的突变相关。喹诺酮类还较少用于幽门螺杆菌的根除治疗，其耐药的产生主要与gyrA基因相关［7］。

而目前幽门螺杆菌毒力基因与其耐药性是否有关，国内外还没有定论。Taneike I等的研究认为CagA阳性的菌株对甲硝唑更敏感［8］。Adnan Khan等认为CagA与幽门螺杆菌耐药性的产生有密切的联系［9］。英国的Elviss等认为耐药性与VacAs1m1有关。Toro C等认为CagA＋的菌株对抗生素的敏感度更高［10］。许国艳等研究表明cagA基因阳性同时存在着rdxA基因变异的菌株能引起幽门螺杆菌对甲硝唑高水平耐药性。KarabiberH等的研究认为vacslc阴性的菌株中，克拉霉素的耐药菌株较多，而在vacAsl和vacAslc阳性的菌株中，甲硝唑更容易发生耐药［11］。意大利的 De Francesco viiS的研究以及我国胡伟国等对儿童Hp菌的基因型与耐药性的关系研究提示毒力基因与耐药性之间并无相关性。本研究cagA基因的检出率为83.87%，CagA＋和CagA－的菌株与阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐药性之间无相关性，其P值分别0.173、0.313、0.659和0.475。在 VacA基因亚型中，sla、slc、m1和m2与阿莫西林耐药性差异（P＝0.387，0.687，0.525，0.615）、克拉霉素耐药性差异（P＝0.687、0.069，0.402，0.503）、甲硝唑耐药性差异（P＝0.083，0.501，0.434，0.448）、左氧氟沙星耐药性差异（P＝0.095，0.402，0.442，0.268）之间无相关性。在现有的研究中，不同国家和地区的研究提示不同的结果，有的提示毒力基因阳性的耐药性更强，而有的则是阴性的耐药性更强，不同的基因型组合也与耐药性有不同的相关性，而不同的药物之间与毒力基因的耐药性也不尽相同。这可能与不同国家和地区的毒力基因的分型的不同相关。也可能不同药物的耐药的发生与毒力基因存在染色体上的关联作用。

综上所述，贵阳地区儿童幽门螺杆菌的的毒力基因主要以cagA＋和slam 2vacA为主。毒力基因cagA和vacA基因与抗生素耐药性之间无相关性。还需扩大样本量研究寻找两者之间的关系，为携带不同毒力基因类型幽门螺杆菌的感染的抗生素选择上提供理论依据。

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