乳腺癌中VEGF－D的表达与微血管密度、微淋巴管密度的关系

段筱娟 李志义△ 杨玉涛 钟美 饶家秋 何常

（1.贵阳市第一人民医院病理科，贵州 贵阳550002；2.贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳550002；3.贵阳医学院附属医院病理科，贵州 贵阳550001）

乳腺癌的诊治取得了重大的进步，但转移复发是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。在浸润转移过程中，微脉管系统的作用不容忽视，经血道转移和淋巴道转移是恶性肿瘤细胞转移的重要途径。血管内皮生长因子D（VEGF－D）是VEGFs成员之一，它可与位于血管内皮细胞上的VEGFR－2结合调节血管生成，与位于淋巴管内皮细胞上的VEGFR－3结合调节淋巴管生成，从而促进肿瘤的转移。本实验通过免疫组化法检测VEGF－D和 MVD（由CD105标记）、MLD（由D2－40标记），探讨乳腺癌组织中VEGF－D的表达及其与MVD、MLD、临床病理参数之间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例收集 收集2009年1月至2013年12月贵阳市第一人民医院和贵阳中医学院第二附属医院病理科存档病例，乳腺癌50例，收集同期乳腺增生症10例作对照。

1.2 免疫组织化学法染色 采用EnVision二步法分别行VEGF－D和CD105、D2－40染色。石蜡切片常规脱蜡至水；3%H2O2去离子水室温孵育10min；蒸馏水漂洗，置于PBS中震荡10min；高压锅热修复；PBS冲洗，滴加一抗，37℃水浴孵育1h；PBS冲洗，滴加二抗，湿盒37℃水浴孵育30min；PBS冲洗，应用DAB溶液显色，显微镜下观察，适时终止；复染、脱水、透明、封片。用PBS缓冲液替代一抗作空白对照，用已知阳性片作阳性对照。VEGF－D抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，CD105和D2－40抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，通用型二抗购自广州深达公司。

1.3 结果判断 以乳腺腺上皮细胞或癌细胞胞浆内出现黄色颗粒为VEGF－D阳性（图1），采用半定量积分法［1］判断结果，每张染色切片随机选取5个染色均匀的高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分率，＜5%赋值为0，5%～25%为1，26%～75%为2，≥76%为3。染色程度标准据每张切片的大多数细胞染色特征决定，没有染色赋值为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。最终结果由阳性细胞百分率与染色强度的乘积决定：0～2分为（－），3～4分为（＋），5～7分为（＋＋），8～9分为（＋＋＋）。CD105阳性表达于血管（图2），D2－40阳性表达于淋巴管（图3），MVD、MLD计数：首先在低倍镜（×100）下找出脉管比较密集的区域，即“热点”区，然后在高倍镜（×400）计数每个区域的脉管数量，取平均值作为MVD、MLD。每张切片选取5个“热点”。

图2 CD105阳性表达于乳腺癌 血管（EnVision法高倍放大）

图3 D2－40阳性表达于乳腺癌淋巴管 （EnVision法低倍放大）

1.4 统计学处理 运用SPSS 16.0统计软件数据包进行数据处理，计量资料比较用t检验，计数资料比较用χ2检验，相关性采用Pearman相关分析，MVD、MLD用¯x±s表示，按检验水准P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料 50例乳腺癌病例的临床病理特征为：年龄34～84岁，中位年龄49岁，＜50岁25例，≥50岁25例；肿瘤≤2cm 18例，＞2cm 32例；组织学类型均为浸润性导管癌，按照WHO乳腺癌病理分级分：Ⅰ级4例，Ⅱ级31例，Ⅲ级15例；淋巴结转移20例，无淋巴结转移30例。

2.2 乳腺癌和乳腺增生症组织中VEGF－D的表达及 MVD、MLD VEGF－D的阳性表达率（64.00%）及 MVD（16.96±8）、MLD（2.37±0.91）在乳腺癌组明显高于乳腺增生症组（10.00%，1.46±0.67，0.86±0.67），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 VEGF－D、MVD、MLD与乳腺癌临床病理参数之间的关系 VEGF－D、MVD、MLD与乳腺癌组织学分级有相关性，MVD和MLD与淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。见表1。

表1 VEGF－D、MVD、MLD与乳腺癌临床病理参数之间的关系

2.4 乳腺癌组织中 VEGF－D的表达与 MVD、MLD之间的关系 乳腺癌组织中VEGF－D表达为（－）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）者 MVD分别为（8.83±3.29）、（17.62±4.31）、（20.75±5.24）、（29.00±6.29），MLD分别为（1.79±0.87）、（2.38±0.55）、（3.00±0.86）、（4.21±0.60），相关性分析显示VEGF－D与 MVD、MLD均呈正相关（P＜0.05）。

3 讨 论

乳腺癌淋巴管生成及其转移成为研究热点。Stacker［2］等发现VEGF－D可以加快肿瘤生长和血管生成，而且用抗VEGF－D的抗体可以遏制肿瘤转移。Gu Y［3］等对61例乳腺癌手术标本的研究发现，VEGF－D在乳腺癌中的表达明显高于乳腺良性病变，癌细胞VEGF－D高表达伴有高的淋巴管密度，此类患者的预后也差，提示VEGF－D在乳腺癌的淋巴管形成中发挥了重要的作用，使癌细胞更具侵袭性，导致不良的预后。本实验中，VEGF－D的表达及MVD、MLD在乳腺增生症组中明显低于乳腺癌组，VEGF－D阳性组的 MVD、MVD高于阴性组的，且VEGF－D的表达水平与 MVD、MLD均呈正相关，进一步证实VEGF－D在脉管的发育上具有双重作用，即可以刺激血管内皮增殖，又可以促进淋巴管生成。本实验结果显示乳腺癌低分化组的MVD、MLD高于中、高分化组，有淋巴结转移组的MVD、MLD高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义，说明乳腺癌组织内的MVD、MLD与肿瘤细胞的分化程度、侵袭能力和淋巴转移均有一定的关系，肿瘤MVD、MLD较高者，有较强的侵袭能力和转移能力。但是VEGF－D阳性率在有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组，分析原因可能是：（1）VEGF－D在不同肿瘤内酶解加工的程度不同；（2）VEGF－D虽然在肿瘤中可刺激淋巴管生成，但在淋巴系统的发展过程中VEGF－D不起重要作用或者是在发展过程中同时存在其他淋巴管生长因子的调控机制，补偿了 VEGF－D的作用［4］。故 VEGF－D参与了乳腺癌血管和淋巴管生成。MVD和MLD与肿瘤的分化程度、侵袭能力和转移密切相关，可作为预测预后和转移的指标。

［1］ 邢传平，刘斌，董亮.免疫组织化学标记结果的判断方法［J］.中华病理学杂志，2001，30（4）：318.

［2］ Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF－D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics［J］.Nat Med，2001，7（2）：186－191.

［3］ Gu Y，Qi X，Guo S，et al.Lymphangiogenesis induced by VEGF－C and VEGF－D promotes metastasis and a poor outcome in breast carcinoma retrospective study of 61cases［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25（7）：717－725.

［4］ Baldwin M E，Halford M M，Roufail S，et al.Vascular endothelial growth factor D is dispensable for development of the lymphatic sydtem［J］.Mol Cell Biol，2005，25（6）：2441－49.