乌司他丁对小鼠肺泡巨噬细胞TREM蛋白表达的影响研究

王耀炜 王惠芳

(西安医学院第二附属医院呼吸科，陕西 西安 710038)



乌司他丁对小鼠肺泡巨噬细胞TREM蛋白表达的影响研究

王耀炜 王惠芳

(西安医学院第二附属医院呼吸科，陕西 西安 710038)

目的 研究乌司他丁对脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)刺激后的小鼠肺泡巨噬细胞(AM)表面TREM蛋白表达的影响，并探讨乌司他丁在AM介导的炎症反应中的作用及机制。方法 培养肺泡巨噬细胞，分为对照组、LPS干预组、LPS+乌司他丁(LU)组。对照组不予处理，LPS干预组给予100 ng/mL LPS，LU组给予100 ng/mL LPS+10 000 U/mL乌司他丁，之后分别在3 h、12 h、24 h用流式细胞仪(FACS)检测AM表面TREM1、TREM2蛋白的表达水平。ELISA检测AM培养上清液中TNF-α表达水平。结果 对照组TREM1、TREM2各时间点的表达差异无统计学意义(P>0.05)。LPS干预组TREM1的表达在3 h上升到最高，24 h时接近正常；TREM2在3 h下降到最低，之后上升。LU组TREM1的表达均明显下降，24 h下降至最低，与LPS组对比差异有统计学意义(P<0.05)；TREM2的表达均明显升高，在24 h升至最高，与LPS组对比差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α的表达对照组各时间点差异无统计学意义(P>0.05)；LPS组在3 h达到最高，之后下降，24 h时接近正常；LU组均明显下降，与LPS组对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 乌司他丁可能通过调节TREM蛋白在LPS致AM介导的炎症反应中起重要作用。

乌司他丁； 髓系细胞触发受体； 肺泡巨噬细胞； 脂多糖

肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)是肺内接触抗原最早的常驻细胞,参与肺内早期炎症的启动与维持。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，其可活化多种炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等,通过参与TLR4介导的信号通路促使大量炎症因子释放失控并产生放大效应,进而打破炎症自限机制,产生自身破坏性的过度炎症反应。

TREM家族受体是新近发现的一组免疫球蛋白超家族受体，多表达于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等，迄今发现至少包括TREM1、TREM2两个受体。AM表面正常情况下即表达TREM1、TREM2受体，在受到LPS刺激后受体表达产生相应的变化分别扩大、抑制炎症。乌司他丁是一种广谱蛋白酶抑制剂，具有抗氧化、清除氧自由基、抑制炎症介质释放的作用，既往多项研究[1]证实其在急性肺损伤，急性呼吸窘迫综合征、脓毒症等中有抗炎及肺保护作用。乌司他丁抗炎作用是否与AM表达的TREM受体有关尚未见报道。本实验设计观察乌司他丁干预LPS刺激后的AM并观察其表面TREM受体的表达规律，旨在进一步探讨乌司他丁在AM介导的炎症反应中的作用及机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 近交系C57BL/6小鼠，8～12周龄(北京中国医学科学院实验动物研究所)，抗小鼠TREM1抗体(R&D公司)，抗小鼠TREM2抗体(R&D公司)，FITC标记的山羊抗大鼠抗体(北京中衫金桥生物技术有限公司)，LPS(德国sigma公司)，ELISA试剂盒(RB公司)，乌司他丁注射液(广东天普生化医药股份有限公司)。

1.2 实验方法 (1)小鼠肺泡巨噬细胞(AM)的分离、培养和纯化：颈椎脱臼法处死小鼠，用95%的酒精浸泡3～5 min，剪开颈部皮肤，并逐层分离致气管。用去尖端七号针头穿入气管内，丝线固定牢固。取1 mL注射器抽取磷酸盐缓冲液(PBS)0.8 mL，并缓慢推入气管，停留1 min后回抽，共6～8次。抽取的肺泡灌洗液(BALF)注入离心管内离心(1 500 r/min)6 min后弃去上清液。底部的细胞沉淀用6 mL RPMI1640混匀制成单细胞悬液，等份接种在3个25 mL的细胞培养瓶中过夜进行AM的贴壁纯化。次日弃去瓶中培养液，用0.02 %的胰蛋白酶消化贴壁的AM,用RPMI1640将消化下来的AM混匀制成单细胞悬液，高倍镜下计数并调整细胞浓度为1.5×106/mL,将其等份接种在3个12孔细胞培养板上，分为三组，对照组、LPS干预组、LU组，每组每个时间点各设三个复孔。(2)药物干预：对照组不做处理，LPS干预组取100 ng/mL LPS分别加入各孔，LU组取100 ng/mL LPS+10 000 U/mL乌司他丁注射液分别加入各孔。(3)流式细胞仪(FACS)检测AM表面TREM的表达：分别在3 h、12 h、24 h各时间点收集以上培养的三组肺泡巨噬细胞进行流式细胞仪检测，CellQuest软件分析。(4)TNF-α的检测：收集各组各孔AM培养上清液,按照ELISA试剂盒说明检测TNF-α含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计数资料以(x±s)表示,采用随机区组设计的单因素方差分析,各时点组间多重比较采用最小显著差法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AM表面TREM1、TREM2的表达 对照组TREM1、TREM2各时间点的表达差异无统计学意义(P>0.05)。LPS干预组TREM1的表达在3 h达到最高，之后逐渐下降，24 h接近正常，3 h、12 h组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。LU干预后TREM1的表达显著下降，24 h下降至最低值，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与LPS组比较各组均差异有统计学意义(P<0.05)；LPS干预组TREM2的表达在3 h降至最低，之后逐渐上升，24 h接近正常，3 h、12 h组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。LU干预后TREM2的表达显著上升，T24 h上升至最高值，与对照组比较T24 h差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

指标组别3h12h24hTREM1对照组56.34±4.56*58.26±6.25*59.68±7.36LPS组136.58±7.48 110.37±9.6465.35±3.36LU组68.25±5.68*46.42±6.38*30.24±9.68*TREM2对照组 162.42±2.91△ 170.58±3.92△180.42±4.91 LPS组106.72±3.56 134.54±3.58166.27±6.37 LU组138.2±9.67△163.35±6.38△203.35±6.38△

注：TREM1各组、各时间点与LPS组比较，*P<0.05；TREM2各组、各时间点与LPS组比较,△P<0.05。

2.2 TNF-α的表达 对照组各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。LPS组在3 h达到最高，之后逐渐下降，24 h时接近正常。LU干预后TNF-α的表达显著下降，24 h下降至最低值，与对照组比较24 h差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

指标组别3h12h24hTNF-α对照组7.59±0.28*8.06±1.36*9.15±1.57LPS组36.58±3.67 25.32±5.1412.79±2.16LU组10.68±1.64*7.67±2.17*4.38±1.84*

注：TNF-α各组，各时间点与LPS组比较,*P<0.05。

3 讨 论

肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)是肺内主要的居留性吞噬细胞，构成呼吸系统防御病原微生物和其他肺损伤因素的第一道防线，既能促进炎性反应，又能抑制炎症的发展[2]，它是呼吸道的免疫核心细胞，也是内毒素(LPS)的主要效应细胞。AM可表达多种膜受体和膜分子，如Toll样受体(toll-like receptor，TLR)、甘露糖受体等。此外，它还可分泌多种细胞因子、小分子炎性介质、补体成分等，参与炎性反应和免疫调节作用。TREM家族是一种新型的免疫球蛋白超家族炎症激发受体，可以调节LPS介导的炎症反应。该家族主要有TREM1、TREM2两个成员，近年来多项研究表明TREM1受体具有扩大炎症的作用，而TREM2受体与之相反有强大的抗炎作用[3]。AM表面在正常情况下即表达TREM受体，在受到LPS刺激后TREM受体的表达产生相应变化来应对所产生的炎症反应，从而达到调控炎症反应的目的。

乌司他丁(UTI)是一种广谱的蛋白酶抑制剂，可以抑制蛋白酶活性，也具有调控细胞因子的作用，能抑制全身炎症反应综合征，从而阻止多脏器功能障碍的发生、发展。另外UTI分子中还具有与细胞膜受体识别和结合的位点。Nakatani等[4]在体外实验中还发现，UTI呈剂量依赖性地抑制细胞外中性粒细胞弹性蛋白酶活性的同时，还抑制其在细胞内的活性和分泌，从而抑制中性粒细胞介导的内皮细胞损伤。大剂量UTI可进一步下调炎症因子水平，从而对脓毒症性肺损伤起保护作用[5]。Li等[6]的研究表明UTI可以通过AMPK/NF-κB通路抑制LPS诱导小鼠急性肺损伤中的炎症介质起到肺保护作用。

UTI是否能识别AM细胞表面TREM受体，并参与调节TREM受体的表达，从而调节炎症反应是我们本次研究的重点。从研究结果来看，正常情况下AM表面即表达一定数量的TREM蛋白，且随时间的变化无显著改变。在受到LPS刺激后TREM1蛋白及TNF-α表达均明显升高，而TREM2表达明显下降，以上变化在LPS刺激后3 h点最明显。用UTI干预后TREM1表达显著下降，到24 h时下降至最低点，而TREM2表达均明显上升，在24 h点时达到最高。从而我们分析AM在受到LPS刺激后产生一系列炎症反应，并生成大量炎症介质，如TNF-α，这些炎症介质可能反馈调节其表面TREM蛋白的表达，使TREM1升高，TREM2下降从而调控炎症反应的平衡，至于是否有其他炎症介质的参与，仍需进一步实验研究。LPS刺激后促炎因子大量表达并占据优势，促进TREM1的高表达会更进一步放大炎症反应从而对机体产生不利影响。UTI干预AM后TREM1、TNF-α的表达均明显下降，而TREM2的表达逐渐上升，均在24 h时变化最明显。从而我们初步推测UTI可能通过识别AM表面的TREM受体并通过调节其变化来减轻LPS对AM造成的失控性炎症损害，具体调控机制可能是通过炎症因及受体表达双重调控来完成。

本实验中LU组随着UTI作用AM时间的延长，在24 h时TREM1、TREM2蛋白以及TNF-α的变化达到最大，考虑其抗炎效应也随干预时间的延长逐渐增强，在24 h时达到最大效率。考虑其对TREM蛋白的识别以及炎症因子的调控需要一定的时间来达到最大化。至于提高UTI干预AM的浓度后是否会对TREM蛋白表达产生更深影响，以及与TREM受体识别后其是通过下游哪条通路、哪些细胞因子之间相互作用来实现信号的传导从而发挥抗炎作用，仍需要进一步研究。

[1] Linder A,Russell JA.An exciting candidate therapy for sepsis:ulinastatin,aurinary protease inhibitor[J].Intensive Care Med，2014，40(8):1164-1167.

[2] Rubins JB.Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword ofinflammation[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167:103-106.

[3] Sharif O，Knapp S.From expression to signaling:roles of TREM-1 and TREM-2 in innate immunity and bacterialinfection [J].Immunobiology,2008，213(9-10)：701-703.

[4] Nakatani K， Takea S， Tsujimoto H， et al． Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediated endothelialcell injury[J].Leukoc Biol，2001，69(2)：241-247.

[5] 陈昊，张丽葳，林兆奋，等．不同剂量乌司他丁对急性肺损伤大鼠MMP-9等炎症因子调控的研究[J]．中国医药导报，2011，8(24)：15-18.

[6] Li W,Qiu X,Jiang H,et al.Ulinastatin inhibits the inflammation of LPS-induced acute Lung injury in mice via regulation of AMPK/NF-ΚB pgthway[J].Int Immunopharmacol,2015,16(15):1567-1569.

Effect of ulinastatin for expression of TREM at alveolar macrophages in mice

WangYaowei，WangHuiFang.

DepartmentofPulmonaryDisease,theSecondAffiliatedHospitalofXianMedicalCollege,Xian710038,Shanxi,China.

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin for expression of TREM after LPS stimulates the alveolar macrophages (AM) and explore mechanism in AM-mediated inflammatory response.Methods Cultured the alveolar macrophages,which were divided into control group,LPS group,and LU group.LPS group was added LPS at the final concentration of 100 μg/mL,and LU group was added LPS at the final concentration of 100μg/mL and ulinastatin the final concentration of 10 000 U/mL.The expression level of TREM1 and TREM2 at 3 h,12 h,24 h time points was detected by flow cytometry (FACS).And the concentration of TNF-α was detected by ELISA method.Results The expression of TREM1 and TREM2 at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).The expression of TREM1,TREM2 and TNF-α that there were statistical significantly differences between LU and LPS group(P<0.05).The expression of TNF-α at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).Conclusion Ulinastatin can adjust the TREM protein in LPS to AM-mediated inflammatory response plays an important role.

Ulinastatin； TREM； Alveolar macrophages； LPS

R-332；R364.5

A

1000-744X(2016)12-1249-03

2016-10-25)