下颌前导后大鼠髁突软骨Runx2的表达研究

秦波 王小玲 徐卫华

(贵州医科大学附属医院口腔正畸科，贵州 贵阳 550004)



下颌前导后大鼠髁突软骨Runx2的表达研究

秦波 王小玲 徐卫华△

(贵州医科大学附属医院口腔正畸科，贵州 贵阳 550004)

目的 观察大鼠下颌持续功能前导后髁突软骨中Runt相关转录因子2(Runx2)的表达，探讨Runx2在大鼠下颌前导后髁突软骨不同部位改建中可能发挥的作用。方法 40只35 D龄雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组，各为20只，实验组大鼠24 h戴自制功能性矫治器引导下颌前伸，对照组不做处理，在试验后第3、7、14、28天时每组处死大鼠5只，采用免疫组化方法观察髁突软骨中Runx2的表达情况。结果 实验组Runx2的表达在实验后第7、14、28天与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；实验组髁突后部区域Runx2的表达与前部和中部比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Runx2可能参与了下颌骨髁状突骨改建过程；下颌前导后髁突软骨不同部位软骨的改建可能不同。

髁突软骨； 下颌前导； Runt相关转录因子2

髁突软骨在髁突表面，是一种特殊形式的结缔组织，不包含神经纤维、血管和淋巴管，是整个下颌骨的生长和发育的中心。髁突的生长改建直接影响下颌的形态和功能。Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)又称核心结合因子α1(core-binding factorα1．CBFA1),Runt相关基因Runx家族蛋白由Runx1、Runx2和 Runx3组成，其共同特点是在他们的分子中含有一个相似的高度保守序列——Runt结构域[1],该结构域与果蝇的成对控制基因Runt序列同源。Runx2是成骨细胞分化和软骨内成骨的主要调节因子，在成骨细胞分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生等过程中均发挥着重要作用。本研究通过模拟临床功能矫治器，建立大鼠下颌持续前导的动物模型，通过检测大鼠髁突软骨前部、中部和后部中Runx2的表达并对其进行定量分析，探讨大鼠下颌前伸后髁突软骨的骨改建及Runx2对髁突不同部位软骨骨改建的影响。报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选择健康雄性35 d龄SD大鼠(贵州医科大学动物实验中心提供)40只，随机分为实验组和对照组，各为20只。大鼠咬合前导装置的制作参照Rabie等[2]，实验组模拟临床功能矫治器引导下颌前伸；对照组不做处理。分别在试验后第3、7、14及28天全麻下处死实验组及对照组每时间段动物各5只。所有动物都以自由饮水、饮食，同环境下饲养直至实验结束。

1.2 主要实验材料 实验材料有：Rabbit Anti-CBFA10.1 mL(200 ug/mL，武汉博士德生物工程有限公司)，增强型(Polink-1)检测试剂盒，PV-6001 兔两步法检测试剂6mL(北京中杉金桥生物技术有限公司)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 组织处理 分别于安装前导装置后的第3、7、14、28天，处死实验组和对照组动物各5只。0.3%戊巴比妥钠1 mL/100 g腹腔注射，组织分离，整块取下髁状突。10%福尔马林溶液固定24 h,EDTA液脱钙4周，常规脱水，石蜡包埋。

1.4 免疫组织化学染色 石蜡纵向切片，脱水，抗原修复，去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶。PBS液洗3次，每次3 min，滴加一抗4 ℃冰箱过夜，PBS液洗3次，每次2 min，加入兔IgG抗体-HRP多聚体工作液37 ℃温箱孵育30 min，PBS液洗3次，每次2 min，DAB显色，自来水终止显色，苏木素染色30 s，自来水冲洗，酸酒精处理10 s,氨酒精1 min脱水透明，树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，大鼠气管软骨组织作为阳性对照，以细胞胞浆为特异黄色或棕黄色为染色阳性。

1.5 图像分析 在矢状切片上通过髁状突前后面最突点作一直线，选取该直线中点以60°为标准将髁状突上部分为前部、中部和后部。OlympusCX31型光学显微镜下应用Pixera PVC100 C系统采图，各组织采集100×图像，Photoshop 8.0软件选取髁突软骨前中后部进行观测，每部分选择连续3个100px×100px大小的区域，计数各区域棕色深染的阳性细胞数。

1.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，实验组与对照组之间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Runx2在髁突软骨前部的表达 对照组中的表达随着观测时间点的向后推移，Runx2的阳性细胞没有显著变化趋势。实验组中Runx2的表达随着观测点的向后推移，Runx2的阳性细胞逐渐增加，实验后第3、7天与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),第14和28天与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验组内Runx2的表达第3天与第7天比较差异无统计学差异(P>0.05)，第3天与14、28天比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

n3d7d14d28d对照组513.20±1.4713.60±1.7113.60±1.6513.40±1.42实验组513.80±1.4114.70±1.6415.80±1.54*15.90±0.99*F0.8712.1569.47020.604P0.3630.1590.006*0.000*

*注：与对照组相比，*P<0.01。

2.2 Runx2在髁突软骨中部的表达 下颌前伸导致了实验组髁突软骨中部Runx2的表达增强，实验后第3天与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验后第7、14和28天与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验组内Runx2的表达第3天与第7、14、28天比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

3d7d14d28d对照组(n=5)14.10±1.2013.90±1.1913.20±1.2913.10±1.52实验组(n=5)14.40±1.1715.80±1.23*16.50±1.64*16.90±1.67*F0.32012.26025.72428.376P0.5780.003*0.000*0.000*

*注：与对照组相比，*P<0.01。

2.3 Runx2在髁突软骨后部的表达 实验组内Runx2的表达实验后第3天与第7、14、28天比较差异均有统计学意义(P<0.01)。同一观测时间点内髁突软骨后部Runx2的表达与中部和前部比较差异有统计学意义(P<0.05)。下颌前伸后髁突软骨后部第3天与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);实验后第7、14和28天表达与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

n3d7d14d28d对照组515.90±1.2015.40±1.2615.00±1.3314.70±1.70实验组516.40±1.1717.80±1.03*18.60±1.71*18.80±1.81*F0.88921.60027.50927.162P0.3580.000*0.000*0.000*

*注：与对照组相比，*P<0.01。

3 讨 论

髁突软骨是直接接触关节盘的部位，因而其改建直接反映了外力对髁突的影响，髁突生长改建直接影响下颌的形态和功能。覆盖于下颌髁突关节表面的纤维软骨，是髁突改建能力的基础，研究[3]表明颞颌关节具有终身改建能力,尤其是在幼年期及青少年改建能力较强。髁突的改建易受环境因素影响，张红梅等[4]通过升高后牙咬合，增加了垂直向的距离，改变了下颌的位置，从而改变了髁突的位置及负荷，髁突进行了适应性改建。

Runx蛋白在多种细胞谱系中发挥着十分重要的作用，Runx1参与造血干细胞的分化，而Runx2在成骨细胞分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生中发挥重要作用，Runx3在胃上皮细胞调控中发挥重要作用。Runx2是首个被证实的成骨细胞特异性转录因子，其能激活与启动骨髓间质干细胞向成骨细胞系分化，还能调节成骨细胞的成熟[5-6]。

Inada等[7]利用原位杂交技术对Runx2在软骨细胞中的表达进行研究，发现随软骨细胞的成熟，Runx2的表达增加明显，在终末肥大软骨细胞中的表达量很大。在前软骨形成细胞ATDC5中，抑制所有Runx蛋白的DN-Runx2(dominant negative Runx2)会抑制细胞凝聚，提示Runx蛋白参与软骨形成的早期阶段。Enomoto等[8]证实在ATDC5细胞中，I型Runx2的表达在细胞分化成为以表达X型胶原为特征的肥大软骨细胞以前就已经上调；用I型Runx2反义寡核苷酸作用于ATDC5细胞后，X型胶原的表达量明显减少，说明其抑制了软骨细胞的成熟；进一步将Runx2作用于小鸡不成熟的软骨细胞，发现其加快软骨细胞的成熟。

本实验中，前导大鼠下颌后髁突软骨Runx2的表达实验组在第7、14、28天强于对照组，实验组随着时间的推移大鼠髁突软骨中Runx2的表达逐渐增强，提示Runx2可能参与了下颌前导后髁突软骨的改建过程，同时Runx2的表达可能与时间有关。实验组髁突软骨后部Runx2的表达强于中部和前部，Runx2是生物力学信号的靶目标，用低振幅机械牵张力连续作用牙周膜细胞能迅速增加Runx2与DNA、成骨细胞特异性元件2的结合能力，凝胶滞留移动实验表明在机械牵张30 min后，可以检测到Runx2与成骨细胞特异性元件2的结合，6 h后达峰值，12 h后仍可检测到。研究表明ERK1/2磷酸化程度在机械拉伸作用下与时间正相关，拉伸激活的ERK能同Runx2结合并使Runx2磷酸化，同时Runx2结合活性与之呈正相关，与本实验中观测到的髁突不同应力区Runx2表达强度不同一致，可能是因为不同应力作用下髁突软骨改建的水平不同，髁突软骨在髁突后部的张应力作用下，髁突软骨细胞增殖明显。

赵志河等[9]通过建立“下颌骨矫形系统”的三维有限元模型，对下颌前导时髁突的受力进行研究，结果显示髁突软骨表面的前部为压应力集中区，后上部则为张力区，髁突发生向前向下的位移，认为前伸下颌能促进下颌髁突的生长，与本实验结果相符。本研究实验组在同一时间点Runx2表达在髁突后部要强于前部和中部，提示Runx2的表达可能与下颌前导后髁突不同部位所产生的应力不同有关。

[1] Levanon D，Negreanu V，Bernstein Y，et al.AML1，AML2 and AML3，the human members of the runt domain gene-family：cDNA structure expression，and chromosomal localization[J]．Genomics，1994，23：425-432．

[2] Rabie AB,Zhao Z,ShenG,et al.Osterogenesis in the glenoid fossa in response to mandibular advancement[J].Am Jorthod Denfacial Orthop,2001,119(4):390-400.

[3] Cholasueksa P,Warita H,Soma K，et al.Alterations of the rat temporomandibular joint in functional posterior displacement of the mandible[J].Angle Orthod,2004,74(5):677-683.

[4] 张红梅，丁寅,王欢，等.升高咬合对青春期大鼠髁突软骨改建的影响[J].第四军医大学学报，2007,28(6)：524-526.

[5] KomoriT.Runx2,amultifunctional transcription factor in skeletal development[J].Cell Biochem,2002,87(1):1-8.

[6] Ken O,Linda JS.Extracellular matrix gene regulation[J].Clin Orthop,2004,427(10):123-128.

[7] Inada M,Yasui T，Nomura S，et a1．Maturational disturbance of chondrocytes in cbfa1-deficient mice[J]．Dev Dyn，1999，214：279-290．

[8] Enomoto H，Enomoto-Lwamoto M，Lwamoto M，et a1．Cbfa1 is a positive regulatory factor in chondrocyte maturation[J]．J Biol Chem,2000,275：8695-8702．

[9] 赵志河，周学东,赵美英.下颌前伸时髁突的三维有限元分析[J].中华口腔医学杂志,1999,34(2):85-87.

Expression of BMP-2 in the condyle of rat during mandibular advancement

QinBo,WangXiaoling,XuWeihua.

DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China.

ObjectiveTo observe the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) in the condyle of rat during mandibular advancement,and explore the possible function in the remodeling of condyle cartilage in response to change of mandibular position.Methods Total of 40 of 35-day-old male Spague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups.Each group consisted of 5 rats with bite-jumping appliance,which caused mandubular protrusion and 5 rats untreated as the control.One group was sacrificed on day 3,7,14 and 28 respectively.The expression of Runx2in the condyle cartilage was examined by immunohistochemical staining.Results The expression level of Runx2in experimental group was higher than in control group on days 7,14,28 (P<0.05)，The expression of Runx2in posterior region was stronger than anterior and middle regions in experimental group (P<0.05).Conclusion Runx2participate in the remodeling activities of cartilage,and has close relations to the endochondral ossification process.Mandibular cartilage remodeling may be different in the stretched region and loaded area.

Condyle cartilage； Mandibular advancement； Runt-related transcription factor 2

R-332；R313；R783.5

A

1000-744X(2016)12-1252-03

2016-10-23)

△通信作者,E-mail:29574748@qq.com