恶性淋巴瘤诊断中Ig/TCR基因重排的分子病理检测分析

武鑫瑞 亓岽东 沈小英 屈悦 张立英 张玉萍 许春伟 吴继华*

(1.解放军306医院病理科，北京 100101；2.大连大学附属中山医院肿瘤科，辽宁 大连 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京军区总医院病理科，北京 100700；5.潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041；6.军事医学科学院附属医院病理科，北京 100071)



恶性淋巴瘤诊断中Ig/TCR基因重排的分子病理检测分析

武鑫瑞1亓岽东2沈小英1屈悦3张立英4张玉萍5许春伟6△吴继华1*

(1.解放军306医院病理科，北京 100101；2.大连大学附属中山医院肿瘤科，辽宁 大连 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京军区总医院病理科，北京 100700；5.潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041；6.军事医学科学院附属医院病理科，北京 100071)

目的 探讨B细胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T细胞性淋巴瘤中TCR基因重排的特点。方法 回顾性分析213 例恶性淋巴瘤和24例淋巴反应性增生组织样本，利用3730毛细血管电泳对提取的DNA进行PCR扩增，检测B细胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T细胞性淋巴瘤中TCR基因重排。结果 B细胞性淋巴瘤中IgHA的总阳性率为43.21%，IgHB的总阳性率为29.63%，IgHC的总阳性率为30.25%，IgHD的总阳性率为16.67%，IgHE的总阳性率为3.09%，IgLκA的总阳性率为42.59%，IgLκB的总阳性率为23.46%，IgLλA的总阳性率为25.93%，IgH(A+B+C+D+E)+IgLκ(A+B)+IgLλA的总阳性率为88.27%；T细胞性淋巴瘤中TCRB-A的总阳性率为31.37%，TCRB-B的总阳性率为58.82%，TCRB-C的总阳性率为23.53%，TCRG-A的总阳性率为60.78%，TCRG-B的总阳性率为21.57%，TCRD的总阳性率为29.41%，TCRβ+TCRγ+TCRδ的总阳性率为78.43%。结论 Ig基因重排和TCR基因重排分别对B细胞性和T 细胞性淋巴瘤的诊断具有重要价值。

淋巴瘤； B细胞性； T细胞性； 基因重排； Ig基因； TCR基因

恶性淋巴瘤是一组起源于淋巴造血系统并具有高度异质性的恶性肿瘤。近年来为适应临床诊治的需求，不断调整其病理分类[1]。WHO(2008版)造血和淋巴组织肿瘤分类是运用病理形态学、免疫组化、分子遗传学和临床特征四者结合的分类系统，为恶性淋巴瘤精准治疗奠定了基础[2]。恶性淋巴瘤中非霍奇金恶性淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)占绝大多数，因其亚型繁多、不典型和混合型存在，给病理诊断带来诸多困难。基因重排检测作为一项分子遗传学诊断，为恶性淋巴瘤诊断提供了具有较高诊断价值的手段。其原理是一般Ig或TCR基因的多克隆性重排多为反应性淋巴组织增生，而恶性淋巴瘤却是所有细胞都来源于同一克隆的单克隆性重排，从而可以通过基因重排检测来诊断淋巴瘤[3]。本实验运用3730毛细血管电泳分析B细胞性淋巴瘤的Ig基因重排和T细胞性淋巴瘤中的TCR基因重排，旨在探讨Ig在B细胞性淋巴瘤和TCR基因重排在T细胞性淋巴瘤分型分类和鉴别诊断中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 收集2013年1月至2015年12月间解放军306医院、大连大学附属中山医院、北京军区总医院和山东省潍坊市人民医院送检的恶性淋巴瘤标本213 例，淋巴反应性增生组织24例。

1.1.2 主要试剂 rTaqDNA聚合酶、10×PCR buffer 购于TaKaRa公司；50 bp marker、2.5 mmol/L dNTP mixture、6×loading buffer 购于天根生化科技有限公司；QIAampDNA FFPE tissue Kit购于QIAGEN公司；引物及内对照参考基因由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 根据组织大小切5～10片4 μm厚的石蜡切片，脱蜡；并按照QIAampDNA FFPE tissue Kit试剂盒说明步骤进行操作。并用紫外分光光度计测定其纯度和浓度备用。

1.2.2 引物设计 选用3730毛细血管电泳检测Ig基因克隆性重排的47条引物(表1)[4]，引物组合后应用于检测重链(IgH)和轻链(IgLκ和IgLλ)，其中IgH分成5组: IgH-A、B、C、D、E，用于检测VH-JH；IgLκ分成两组，用于检测Vκ-Jκ和Vκ-κde，包括IgLκ-A、B；IgLλ用于检测Vλ-Jλ。TCR基因克隆性重排分析的56 条引物[4]，引物组合后用于检测TCRβ、TCRγ、TCRδ链，其中TCRβ分成TCRB-A、B、C 3组，用于检测Vβ-Jβ和Dβ-Jβ；TCRγ检测Vγ-Jγ，包括TCRG-A、B两组；TCRδ检测Vδ-Dδ-Jδ。同时还包含了内对照S引物4条，其扩增产物片段长度分别为101，200，300和395 bp。

1.2.3 PCR 扩增 采用25 μL 扩增体系：0.1 μmol /L引物，10×PCR buffer，0.2 mmol /L dNTP Mixture，2U rTaq DNA 聚合酶。PCR反应条件为：94 ℃预变性，10 min；94 ℃，45 s；60 ℃，45 s；72 ℃，90 s；循环40次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 毛细管电泳及基因扫描分析 PCR扩增产物于ABI 3730XL遗传分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper-v4.1软件对基因扫描数据进行分析。结果判读标准为各管扩增产物大小需落在有效检测范围内，且收集到扩增产物的不连续信号单峰视为阳性条带，若未收集到荧光信号或搜集到表现为高斯分布的钟形曲线连续荧光信号，则视为阴性结果。样本DNA质量分析为4条内对照引物分别扩增101，200，300，395 bp目标条带，用于评估所提组织DNA的质量和完整性。如果标本未能检测出内标引物扩增的目的条带，则视为DNA质量不合格，不继续进行检测。

2 结 果

2.1 B细胞性淋巴瘤Ig基因重排分析 B细胞性淋巴瘤Ig基因重排分析，见表1。14例淋巴组织反应性增生中未扩增出Ig基因的单克隆重排条带。

表1 Ig基因重排类型与B细胞性淋巴瘤组织类型的关系

2.2 T细胞性淋巴瘤TCR基因重排分析 T细胞性淋巴瘤TCR基因重排分析，见表2。10例淋巴组织反应性增生中未扩增出任何TCR基因的单克隆重排条带。

表2 51例TCR基因重排类型与T细胞性淋巴瘤组织类型的关系

3 讨 论

恶性淋巴瘤作为常见肿瘤，近年来发病率和死亡率在全球范围内明显增加，其中发病率占恶性肿瘤的4%～5%，居第6位，死亡率占恶性肿瘤的3%～4%，居第9位[5]。国内恶性淋巴瘤发病率和病死率分别居所有恶性肿瘤的第11位和第7位[6]。

非霍奇金恶性淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)占恶性淋巴瘤的绝大多数[2-3]，从起源角度可分为B淋巴细胞(90%～95%)、T淋巴细胞(5%～7%)或自然杀伤NK细胞(<2%)[4]。B淋巴细胞编码Ig肽链的基因，通过有序的V-D-J基因重排组合、拼接而成[4,7-8]。T淋巴细胞编码于α、γ和β、δ肽链的基因，通过有序的由V-J-C和V-D-J-C基因重排组合、拼接而成，而且所有的肿瘤细胞都起源于同一克隆的单克隆性重排，表现为Ig基因或TCR基因的单克隆性重排。恰恰相反正常淋巴组织和反应性淋巴组织增生组织细胞起源不同，为是Ig基因或TCR基因的多克隆性重排。

B细胞性淋巴瘤Ig基因重排方面陈愉等[9-10]检测113例 B细胞性淋巴瘤发现IgH克隆性重排的阳性率为82.30%；潘鑫艳等[11]检测46例弥漫大B细胞淋巴瘤发现IgH克隆性重排的阳性率为91.30%，Igκ克隆性重排的阳性率为82.61%，Igλ克隆性重排的阳性率为36.96%；本研究162例B细胞性淋巴瘤中IgHA的总阳性率为43.21%，IgHB的总阳性率为29.63%，IgHC的总阳性率为30.25%，IgHD的总阳性率为16.67%，IgHE的总阳性率为3.09%，IgLκA的总阳性率为42.59%，IgLκB的总阳性率为23.46%，IgLλA的总阳性率为25.93%，IgH(A+B+C+D+E)+IgLκ(A+B)+IgLλA的总阳性率为88.27%。

T细胞性淋巴瘤TCR基因重排方面陈愉等[11]检测45例 T细胞性淋巴瘤发现TCRD阳性率为91.11%；张静等[12]检测50例T细胞性淋巴瘤发现TCRG、TCRB和TCRD基因重排阳性率分别为的标本分别为94.00%，84.00%和36.00%，三者联合检出率为96.00%。本研究51例T细胞性淋巴瘤中TCRB-A的总阳性率为31.37%，TCRB-B的总阳性率为58.82%，TCRB-C的总阳性率为23.53%，TCRG-A的总阳性率为60.78%，TCRG-B的总阳性率为21.57%，TCRD的总阳性率为29.41%，TCRβ+TCRγ+TCRγ的总阳性率为78.43%。

综上所述，NHL因为种类繁多、分类庞大，形态学及免疫组化结合基因重排对恶性淋巴瘤的诊断具有重要价值。

[1] Roman E, Smith AG. Epidemiology of lymphomas[J]. Histopathology, 2011, 58(1): 4-14.

[2] 吴永芳, 许春伟, 韩鸿雁, 等. 443例恶性淋巴瘤临床病理特征分析[J].临床与病理杂志, 2015, 35(7): 1268-1275.

[3] 罗莹, 陈晓琴, 周力. 原发性消化系统非霍奇金淋巴瘤17例临床分析[J].贵州医药, 2015, 39(4): 336-337.

[4] van Dongen JJ, Langerak AW, Bruggemann M, et al. IDesign and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 [J]. Leukemia, 2003, 17(12): 2257-2317.

[5] 陈玥, 王丽, 潘鑫艳, 等. Ig基因重排检测在B细胞性淋巴瘤诊断中的应用[J]. 诊断病理学杂志, 2011, 18(3): 186-189.

[6] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1): 7-30.

[7] Rezuke WN, Abernathy EC, Tsongalis GJ. Molecular diagnosis of B-and T-cell lymphomas: fundamental principles and clinical applications[J]. Clin Chem, 1997,43(10): 1814-1823.

[8] Garcia MJ, Martinez-Delgado B, Granizo JJ, et al. IgH, TCR-gamma, and TCR-beta gene rearrangement in 80 B-and T0cell non-Hodgkin's lymphomas: study of the association between proliferation and the so-called "aberrant" patterns[J]. Diagn Mol Pathol, 2009,10(2): 69-77.

[9] 贾雯, 马小兵. TCR基因重排检测在T细胞淋巴瘤病理诊断中的作用[J]. 临床与病理杂志, 2014, 34(5): 636-642.

[10] 陈愉, 杜洪, 胡维维, 等. 非霍奇金淋巴瘤365例WHO新分类的临床病理分析[J]. 诊断病理学杂志, 2004, 11(5): 304-307.

[11] 潘鑫艳, 王丽, 陈玥, 等. 弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫球蛋白基因重排特点及规律研究[J]. 解放军医药杂志, 2012, 24(9): 7-11.

[12] 张静, 张太明, 杨飞, 等. 毛细管电泳—基因扫描分析在淋巴瘤T细胞受体基因重排检测中的应用[J]. 中华病理学杂志, 2013, 42(9): 615-617.

The molecular pathology detection analysis of Ig/TCR gene rearrangement in malignant lymphoma diagnosis

WuXinrui1,QiDongdong2,ShenXiaoying1,QuYue3,ZhangLiying4,ZhangYuping5,XuChunwei6,WuJihua1.

1.DepartmentofPathology,the306HospitalofPLA,Beijing100101,China. 2.DepartmentofOncology,AffiliatedofZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China. 3.BeijingXinjiYongkangGeneScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100085,China. 4.DepartmentofPathology,theMilitaryGeneralHospitalofBeijingPLA,Beijing100700,China. 5.DepartmentofPathology,ThePeople'sHospitalofWeifang,Weifang261041，China. 6.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China.

Objective To analyze the character of the Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement in T cell lymphoma. Methods A retrospective analysis of 213 cases of samples with malignant lymphoma and 24 cases of samples with reactive lymphoid hyperplasia, which were used to extract DNA for PCR amplification by 3730 capillary electrophoresis and had detected Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement in T cell lymphoma. Results Among B cell lymphoma, the total IgHA positive rate was 43.21%, the total IgHB positive rate was 29.63%, the total IgHC positive rate was 30.25%, the total IgHD positive rate was 16.67%, the total IgHE positive rate was 3.09%,the total IgLκA positive rate was 42.59%, the total IgLκB positive rate was 23.46%, the total IgLκB positive rate was 25.93% and , the total IgH (A+B+C+D+E)+IgLκ (A+B)+IgLλA positive rate was 88.27%. Among T cell lymphoma, the total TCRB-A positive rate was 31.37%, the total TCRB-B positive rate was 58.82%, the total TCRB-C positive rate was 23.53%, the total TCRG-A positive rate was 60.78%, the total TCRG-B positive rate was 21.57%, the total TCRD positive rate was 29.41% and the total TCRβ+TCRγ+TCRδ positive rate was 78.43%. Conclusion It has an important value for Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement.

Lymphoma； B cells； T cells； Gene rearrangement； Ig gene； TCR gene

R733.1

A

1000-744X(2016)09-0908-03

2016-06-06)

△*通信作者，△E-mail：xuchunweibbb@163.com；*E-mail：jh_02821@126.com