支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞变化及其活动状态相关性分析

夏治 汤文 黄成娇 许慧

(湖北省妇幼保健院儿童重症医学科,湖北 武汉 430070)



支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞变化及其活动状态相关性分析

夏治 汤文 黄成娇 许慧

(湖北省妇幼保健院儿童重症医学科,湖北 武汉 430070)

目的 探讨支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞( CD4+CD25+Treg)变化及其活动状态相关性。方法 选取80例患儿为观察组研究对象，另选取健康个体40例作为对照组。将80例患儿分为急性期组和缓解期组，另将患儿划分为轻度组、中度组、重度组。对所有患儿进行细胞分离培养和流式细胞数检测，得出外周血Th17和CD4+CD25+Treg表达水平。比较观察组和健康对照组的外周血Th17、CD4+CD25+Treg以及不同病情患儿、不同时期患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg。结果 观察组患儿Th17、CD4+CD25+Treg分别为(2.86±0.45)，(5.36±0.73)，健康对照组为(1.05±0.31)，(7.13±0.88)，观察组Th17明显升高，CD4+CD25+Treg明显降低(P<0.05)。患儿疾病由轻到重，外周血Th17呈现上升趋势，而CD4+CD25+Treg呈下降趋势，重度患儿Th17明显高于中度和轻度患儿，CD4+CD25+Treg明显低于中度和轻度患儿(P<0.05)。哮喘急性期和缓解期患儿Th17均明显升高，急性期Th17为(2.29±0.88)，缓解期为(1.62±0.40)，急性期患儿Th17明显高于缓解期组，哮喘急性期和缓解期患儿CD4+CD25+Treg均明显降低，两组分别为(5.41±0.82)，(6.12±0.89)，CD4+CD25+Treg明显低于缓解期组(P<0.05)。结论 Th17表达与支气管哮喘患儿疾病严重程度呈正相关，CD4+CD25+Treg与疾病严重程度呈负相关，CD4+CD25+Treg和Th17可作为诊断支气管哮喘的临床指标。

支气管哮喘； Th17； CD4+CD25+； CD4+CD25+Treg； 活动状态

支气管炎临床上又名哮喘，研究[1]认为该病是一种免疫调节异常性疾病。Th17细胞是一种新型效应性CD4+T细胞亚群，外周血Th17和CD4+CD25+的表达可能与哮喘疾病有重要关系[2]。为了探讨支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞( CD4+CD25+Treg)变化及其活动状态相关性，我院尝试开展本研究，并取得了不错的效果，现报告如下。

1资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年8月于我院接受治疗的80例患儿为观察组研究对象，另选取健康个体40例作为对照组。本研究方案报送本院医学伦理委员会并获得批准后展开工作。本研究参与人员均明确本研究的目的及其意义，签署书面知情同意书。所有患儿在入院之前均符合全国儿童哮喘防治协作组制定的关于儿童哮喘疾病诊断标准，排除心、肝、肾等严重疾病及非首发患儿。按照患儿病情，将80例患儿分为急性期组和缓解期组，在急性期组中，男性患儿为23例，女性患儿为17例，平均年龄为(4.15±1.24)岁；在缓解期组中，男性患儿为22例，女性患儿为18例，平均年龄为(4.34±1.04)岁。对照组中，男性23例，女性17例，平均年龄为(4.22±1.12)岁。另外，根据《儿童支气管哮喘诊断及防治指南》将患儿划分为轻度、中度、重度，三组中男性患儿、女性患儿比分别为9∶18，10∶17，9∶17，平均年龄分别为(4.17±1.05)岁，(4.21±1.09)岁，(4.20±1.13)岁，各组患儿一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 器材 采用美国Biosource公司生产的PerCP-小鼠抗人CD4单克隆抗体(mAb)IgG1，异硫氰酸荧光素-抗人IL-17mAbgG、同型对照IgG1。采用ebioscience公司生产的人调节性T细胞荧光抗体标记试剂盒等。

1.3 方法 细胞分离培养：抽取患儿清晨空腹静脉血5～10 mL，离心(频率为2 000 r/min，25 min)后，分离PBMC，然后经Hank洗涤液洗涤2次后重悬于RPMI-1640培养基(含有100 mL/L胎牛血清)，然后用锥虫蓝染色进行活性检验。之后将其培养与24孔板中，向培养孔中注入终浓度PMA 50 μg/L、离子霉素750 μg/L、高尔基体阻断剂莫能星2.0 μmol/L，混合均匀后，将其置入二氧化碳培养箱中进行培养，4 h后转移细胞悬液至装有1.5 mL的EP试管内，重复上述离心操作8 min，然后分离取出上清液，选取PBS液洗涤2次，选取2×106 PBMC进行流式细胞术Th17细胞的检测。流式细胞数检测：首先将细胞均分至对照管和观察管，加入110 μL的PerCP-小鼠抗人CD4 mAbIgG，混合均匀，静置于室温中，20 min后，将细胞表面抗原染色。注入Cytofix/Cytoperm液200 μL，置于4 ℃低温静置20 min细胞固定后，进行洗涤操作，然后染色胞内细胞因子。分别向观察管中注入110 μL的FITC-抗人IL-17mAbIgG1；对照管中注入同型对照抗体，然后在4 ℃低温下静置避光孵育，约30 min后，用洗涤液洗涤2次，用300 μL洗涤液重悬细胞，24 h内选取FCM进行检测。选用CD4直方图设门区分Th细胞，以散点图IIL-17染色养性表示Th17细胞，用Cellsquest软件获取并分析数据。再选取PBMC悬液，分别置于对照管和观察管中，洗涤后细胞重悬于200 μL洗液中，加入FITC抗人CD4 mAb和APC抗人CD25 mAb，进行孵育，操作同上。洗涤后，再加入Fix/Perm液固定/穿膜，同样进行孵育，操作同上。然后在进行Perm/Wash液洗涤，留200 μL悬浮细胞。再向观察管中加入PE抗人Foxp3抗体，向对照管中加入同型对照抗体，重复上述孵育过程，延长孵育时间为60 min后进行流式细胞检测。用CD4、CD25设门区分出CD4+、CD25+细胞，用散点图表示Foxp3+细胞。

1.4 观察指标 (1)两组患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较。包括：80例观察组患儿及40例健康对照组患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg总体情况比较。(2)不同病情患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较。包括：轻度、中度重度患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg水平比较。(3)不同时期患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较。包括：哮喘急性期患儿、哮喘缓解期患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg水平比较。

2 结 果

2.1 两组患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较 观察组患儿Th17、CD4+CD25+Treg分别为(2.86±0.45),(5.36±0.73)，健康对照组为(1.05±0.31),(7.13±0.88)，观察组Th17明显升高，CD4+CD25+Treg明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同病情患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较 患儿疾病由轻到重，外周血Th17呈现上升趋势，而CD4+CD25+Treg呈下降趋势，重度患儿Th17明显高于中度和轻度患儿，CD4+CD25+Treg明显低于中度和轻度患儿，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同病情患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较(%)

注：轻度组和中度组相比，△P<0.05；轻度组与重度组相比，*P<0.05。

2.3 不同时期患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg比较 哮喘急性期和缓解期患儿Th17均明显升高，急性期Th17为(2.29±0.88)，缓解期为(1.62±0.40)，急性期患儿Th17明显高于缓解期组，哮喘急性期和缓解期患儿CD4+CD25+Treg均明显降低，两组分别为(5.41±0.82),(6.12±0.89)，CD4+CD25+Treg明显低于缓解期组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

研究[3]显示，支气管哮喘主要特征是气道炎症、气道重塑。而且随着气道炎症的持续，气道重塑进一步发展，是导致气道高反应性的原因之一。儿童由于免疫系统发育不完善，CD4+T细胞各亚群的表达与成年人有所不同，CD4+T细胞各亚群对支气管哮喘患儿免疫系统的作用具有重要意义[4]。Th17细胞应答和气道中性粒细胞的浸润对支气管哮喘小鼠的气道高反应性具有主导作用，而且原因可能是Th2及Th17等多种因素共同作用的结果[5]。国外研究[6]通过建立小鼠模型，发现Th17具有增强哮喘小鼠气道炎症及高反应性的作用。IL-17主要产生于Th17细胞，能够有效促进支气管纤维母细胞、上皮细胞核平滑肌细胞的活化，进而促进IL-6、TL-8及粒细胞集落刺激因子等含量增加，进而对中性粒细胞在起到局部的浸润增殖发挥促进作用，增强气道内炎症反应。研究[7-8]发现，重度支气管哮喘患儿和重度支气管哮喘患儿外周血Th17细胞与血浆IL-17的含量均明显升高，而间歇—轻度哮喘患儿却未出现大量表达，提示Th17细胞应答增强与支气管哮喘病情程度有密切联系。并且，Th17细胞可有道Th2活性，引起是中性粒细胞聚集及TgE产生，因此Th17间接参与了气道重塑过程，Th17表达与气道重塑的严重程度或疾病的严重程度呈正相关。

在阳性率检查方面，有研究[9]发现急性期支气管哮喘患儿感染支原体阳性表达率为20%，还有研究[10]发现其感染衣原体阳性表达率为21%、12%。而且，患儿疾病由轻到重，外周血Th17呈现上升趋势，急性期明显比缓解期高，患病患儿明显比健康者高，而CD4+CD25+Treg呈现的趋势刚好相反，可见，Th17细胞核CD4+CD25+Treg细胞具有联合介导细胞免疫损伤的功能，加之支气管哮喘患儿自身Th17/Treg失衡，进一步加剧炎症反应，导致气道壁增厚，上皮下纤维化，平滑肌增生肥大，黏液腺分泌亢进且微血管生成。一项报道[11]显示，同各国对支气管哮喘患儿痰液和外周血进行检测发现，CD4+CD25+Treg表达明显减少，进一步研究发现，中重度患儿CD4+CD25+Treg较少较轻度患儿更明显，重度患者CD4+CD25+Treg减少最明显，而临床症状研究发现，患病小鼠CD4+CD25+Treg较少的同时过敏原诱导的气道反应性明显增加，由此提示CD4+CD25+Treg表达减少可能引起哮喘的病情加剧。有学者[12]认为，Th17和CD4+CD25+Treg细胞的分化之间存在关联，在患儿体内可能存在着Th17/Treg平衡，而Th17/Treg失衡在多种自身免疫疾病中普遍存在，Th17/Treg一旦失衡，对患者机体的炎症反应具有促进作用，这在一定程度上加重了疾病的程度。本研究中，支气管哮喘中度、重度患儿明显高于健康对照组，而CD4+CD25+Treg却明显低于健康对照组，可见，在支气管哮喘患儿中存在Th17/Treg失衡现象。

[1] 向莉,饶小春,焦安夏,等. 婴幼儿支气管哮喘和闭塞性细支气管炎患儿肺功能比较[J]. 临床儿科杂志,2012,2(7):120-123.

[2] 卢根,靳蓉,苏守硕,等. 贵阳市儿童哮喘患病状况及其影响因素分析[J]. 贵州医药,2012,12(9):1076-1079.

[3] 陈啸洪,李华浚,姚欢银,等. 外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞变化与患儿支气管哮喘活动状态的相关性研究[J]. 中国全科医学,2015,8(3):969-971.

[4] 单世民,毛毅敏,孙瑜霞. Th17细胞在支气管哮喘小鼠发病机制中的作用研究[J]. 中国现代医学杂志,2015,25(5):21-24.

[5] 杨永红,王树辉,袁军. ConA对CD4+CD25+调节性T细胞表面CCR4表达的影响[J]. 贵州医药,2015,9(27):840-842.

[6] 席素雅,刘建强,陈树珍,等. 白介素13基因+2044G/A多态性与支气管哮喘的关联研究[J]. 贵州医药,2015,10(12):877-879.

[7] 陆婧,任宇,杨伟明,等. 免疫磁珠法分离乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127(dim/-)调节性T细胞的研究[J]. 贵州医药,2015,9(18):833-834.

[8] 施宇衡,时国朝,万欢英,等. 支气管哮喘患者外周血Th17、CD4+CD25+Treg细胞表达特征[J]. 中国免疫学杂志,2010,8(9):740-743.

[9] 孔晓梅,韩葆芬,张彩苹,等. 支气管哮喘急性发作期的病原学分析[J]. 中华医院感染学杂志,2014,1(9):58-60.

[10] 黄东晖,吴少丽,王慧贤,等. 喘可治注射液通过调节Th17/Treg平衡抑制哮喘模型小鼠气道炎症的实验研究[J]. 中药材,2014,3(6):478-481.

[11] 闫丽丽,康小龙,何承辉,等. 香青兰总黄酮对支气管哮喘大鼠Th1/Th2免疫失衡的调节作用[J]. 中国医科大学学报,2013,1(3):8-9.

[12] 邵莉,邹寒冰,朱丽君,等. 支气管哮喘患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞变化及其尘螨过敏状态的测定[J]. 免疫学杂志,2011,79(6):603-605.

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