热疗联合5氟尿嘧啶对裸鼠移植性MKN45胃癌细胞凋亡的研究

杨卫东 张祎 安琳 许敏 李海飞 李磊 郭芳 朱红伟 王素绢 汤若琪

(1.保定市第二医院，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000；3.河北医科大学,河北 石家庄 050017)



热疗联合5氟尿嘧啶对裸鼠移植性MKN45胃癌细胞凋亡的研究

杨卫东1张祎1安琳2△许敏1李海飞1李磊1郭芳1朱红伟1王素绢1汤若琪3

(1.保定市第二医院，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000；3.河北医科大学,河北 石家庄 050017)

目的 探讨热疗联合5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗对小鼠MKN45肿瘤模型细胞凋亡的影响。方法 建立裸鼠模型，分为空白对照组、5-FU、热疗组和热疗联合5-FU。流式细胞仪测定凋亡率，免疫组化分析技术(ICH)测定瘤组织表皮细胞生长因子受体(EGFR)和凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达变化。结果：热疗联合5-FU组小鼠MKN45细胞凋亡率最明显(P<0.05)，EGFR和Bcl-2蛋白降低最显著(P<0.05)。二者表达呈正相关关系(R=0.914)。结论 热疗联合5氟尿嘧啶能增加MKN45肿瘤细胞凋亡可能通过下调EGFR和Bcl-2的表达有关。

热化疗； 凋亡； EGFR； Bcl-2

肿瘤热疗是利用恒温热水浴加热肿瘤组织，杀灭癌细胞治疗恶性肿瘤的方法，近几年得到快速发展[1-2]。因此热疗联合化疗治疗肿瘤可以发挥协同作用[3]。本实验观察热疗联合5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导细胞凋亡的作用。

1 材料及方法

1.1 实验动物及分组 健康的雄性裸鼠40只，体质量18～20 g，人胃癌细胞株MKN45。

1.2 实验方法 裸鼠接种MKN45肿瘤细胞悬液，测瘤体生长至1 cm3时处理。空白对照组裸鼠常规饲养， 5-FU化疗组裸鼠腹腔注射5-FU 0.2 mg/只,热疗组予(43±0.2)℃恒温水浴加热1 h。热化疗组处理同上。处死小鼠，70%乙醇4 ℃固定保存瘤组织，用于流式细胞分析； 10%中性甲醛固定免疫组织化学染色分析。

1.3 检测方法 流式细胞术分析 取1.0 mL单细胞悬液，加入10%鸡红细胞为内参标准，加碘化丙啶(PI)，4 ℃冰箱中染色，上机测细胞凋亡率。免疫组织化学测定EGFR和Bcl-2蛋白表达 10%中性甲醛固定瘤组织，70%乙醇梯度脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片，二甲苯脱蜡至水，抗原修复，加EGFR和Bcl-2单克隆抗体，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为空白阴性对照，EGFR和Bcl-2阳性表达在细胞胞膜或胞浆呈棕黄色。染色范围分0～4级：阴性为0，阳性细胞1%～25%为1， 26%～50%为2， 51%～75%为3，76%～100%为4。染色强度分为0～3级：阴性为0分，弱阳性为1分，中等强度为2分，强阳性为3分，积分为二者之和。计数10个视野。EGFR、Bcl-2指数PI=阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%

1.4 统计学方法 采用SPSS软件进行单因素方差分析、直线相关与回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组流式细胞仪检测情况 各组凋亡率分别为(2.00±0.02)，(16.91±0.09)，(7.50±0.16)，(28.64±0.09)热疗联合5-FU的细胞凋亡率分别显著高于热疗、5-FU化疗组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 EGFR、Bcl-2蛋白表达测定 各组EGFR蛋白表达分别为(4.66±0.47)，(4.05±0.54)，(3.52±0.62)，(3.02±0.58)； Bcl-2蛋白分别为(4.00±0.76)、(3.70±0.77)，(3.40±0.74)，(3.00±0.53)；热疗联合5-FU明显降低EGFR 和Bcl-2蛋白表达 (P<0.05)。

3 讨 论

胃癌是一种异质性较强的消化系统常见肿瘤，其发病率居我国恶性肿瘤第三位，全球胃癌患者中约40%为中国居民[4]。5-FU为临床主要应用于消化系统肿瘤的化疗药。5-FU可在细胞内转化成细胞毒性代谢产物，并与DNA和RNA结合，抑制DNA合成导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。5-FU抑制NF-kappaB信号转导和阻断血管形成而抑制破骨细胞形成阻断巨大细胞生长[5]。

EGFR是表皮细胞生长因子，它的过表达和肿瘤细胞的侵润、种植、转移、病人预后差有关。实验结果[6-7]表明靶向EGFR/VEGFR2通路治疗肺癌可诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。Francisco Azuaje[8]发现靶向EGFR通路治疗胶质细胞瘤抑制耐药。A.M Unni[9]研究表明降低联合减低EGFR和RAS二者表达治疗肺癌。Z.Zhang[10]应用YM155降低骨肉瘤细胞Bcl-2表达诱导凋亡。YM155成为治疗骨肉瘤的新药物[10]。

本实验结果表明各处理组都可诱导肿瘤细胞凋亡，均可降低EGFR和Bcl-2的蛋白表达，热疗联合5-FU化疗组细胞凋亡率最高，EGFR和Bcl-2的蛋白表达最低。由此可提示热疗联合化疗有可能是通过下调EGFR和Bcl-2表达而诱导细胞凋亡。

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R735.2，R730.58

B

1000-744X(2016)09-0926-02

2016-04-01)

科研立项号:热化疗及基因治疗对胃癌抑制、凋亡及血管生成的研究(16ZF039)

△通信作者，E-mail：173745817@qq.com