改良Gallyas-Braak嗜银染色在阿尔茨海默氏病中的应用

曹莉 曹颖 文安智 官志忠

(1．水城矿业集团总医院病理科，贵州 六盘水 553001； 2．贵州省人民医院病理科,贵州 贵阳 550002；3．贵州医科大学病理教研室，贵州 贵阳 550004 )



改良Gallyas-Braak嗜银染色在阿尔茨海默氏病中的应用

曹莉1曹颖2△文安智2官志忠3

(1．水城矿业集团总医院病理科，贵州 六盘水 553001； 2．贵州省人民医院病理科,贵州 贵阳 550002；3．贵州医科大学病理教研室，贵州 贵阳 550004 )

阿尔茨海默病； 改良Gallyas-Braak嗜银染色； 老年斑； 神经原纤维缠结

中枢神经系统变性疾病是一组原因不明、具有选择性神经元和胶质细胞变性特征的疾病，包括阿尔茨海默病(AD)、多系统萎缩、Pick病及进行性核上性麻痹等。这些变性疾病有各自特殊的组织学病变，需经特殊嗜银染色或相应蛋白的免疫组织化学染色才能显示。国外多采用修订的Gallyas-Braak嗜银染色方法代替传统的Bodian或Bielschowsky嗜银染色方法显示AD 脑组织中神经细胞外老年斑(SP)、神经细胞内神经原纤维缠结(NFTs)、胶质细胞胞浆内包涵体等改变[1-2]。近年来国内对该方法也逐渐引起重视[3-4]。我们参照文献[3]在AD患者尸解脑标本中进行了检测并做了进一步的改进，取得了良好的效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 AD患者及老年同龄对照者尸体解剖后脑海马组织标本由荷兰Amsterdam 脑库提供。其中AD患者10例，男性3例，女性7例，平均年龄为(81.8±7.3)岁，经美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)诊断标准及病理学诊断标准确诊AD，死后尸体解剖平均延迟时间为(4.9±1.1) h；老年同龄对照者8例，男性4例，女性4例，平均年龄为(79.8±12.8)岁，经临床和病理学诊断排除神经系统疾患，死后尸体解剖平均延迟时间为(7.1±2.8) h。脑组织固定于中性甲醛液，脱水后石蜡包埋，分别制作4 μm及8 μm石蜡切片待下一步检测。

1.2 试剂 Gallyas-Braak 嗜银染色试剂购于北京化学试剂公司；鼠抗Aβ1-42单克隆抗体、兔抗PHF-1多克隆抗体及EnVision检测试剂盒分别购于Dako、Sternberger及Dako公司。

1.3 Gallyas-Braak 嗜银染色试剂原液配制 (1)硝酸镧液：将0.5 g硝酸镧、2 g醋酸钠加入100 mL蒸馏水；(2) 碱性碘化银液：将4 g氢氧化钠、10 g碘化钾加入50 mL蒸馏水中，搅拌至清亮，加入1% 的硝酸银3.5 mL，大力搅拌待沉淀消失，加蒸馏水将体积调至100 mL；(3) 显影原液 I∶50 g无水碳酸钠加入1 000 mL蒸馏水中；显影原液Ⅱ：依次将2 g硝酸铵、2 g硝酸银、10 g硅钨酸加入1 000 mL蒸馏水；显影原液Ⅲ：依次将2 g硝酸铵、2 g硝酸银、10 g硅钨酸、6.1 mL 40%的甲醛溶液加入1 000 mL蒸馏水中。将配置好的显影原液Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ保存在黑色瓶中。使用前现取适量显影原液 Ⅱ 加入等量显影原液Ⅰ中，剧烈搅拌，再加入等量显影液 Ⅲ，剧烈搅拌至澄清。

1.4 改良Gallyas-Braak 嗜银染色步骤 (1) 8 μm 厚石蜡切片脱蜡至水洗；(2) 0.3%高锰酸钾液 10 min，自来水冲洗后蒸馏水冲洗；(3) 1% 草酸液 1 min，自来水冲洗后蒸馏水冲洗；(4) 硝酸镧液 1 h，蒸馏水洗 3 次，5 min/次；(5) 碱性碘化银液 37℃ 温箱孵育45 min，1% 醋酸洗 3 次，1 min/次；(6) 显影液显影约20～30 min，观察切片变成淡棕色停止； (7) 1% 醋酸洗3 次，1 min/次；(8) 0.5% 氯化金溶液30 s～2 min，蒸馏水冲洗；(9) 1% 硫代硫酸钠溶液固定 1 min，水洗10 min；(10) 乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 Aβ1-42、PHF-1免疫组化学染色步骤 Aβ1-42、PHF-1免疫组织化学染色4 μm厚石蜡切片行Aβ1-42、PHF-1免疫组织化学组化染色，采用EnVision二步法，按照说明书进行操作，一抗Aβ1-42及PHF-1工作浓度分别为1∶50及1∶100， PBS替代一抗作阴性对照。

1.6 SP及及NFTs计数方法[5]于40倍显微镜视野下，对10例AD患者脑海马CA4、CA3及CA1区1 mm×1 mm 的镜下划线方格内的 SP 及 NFTs 计数，每张切片数10个视野，最后得出每个部位SP及NFTs每平方毫米平均数 (个/mm2)。

2 结 果

2.1 改良Gallyas-Braak 嗜银染色 AD患者与老龄对照者正常神经细胞、神经纤维、胶质细胞均不显色，10 例AD患者海马组织见棕褐色SP结构(图1A)，弥散斑和经典斑均可见，神经细胞内见棕黑色NFTs (图1B)，8例老龄对照者中3例见少量SP，均为弥散斑；8例均未见NFTs。

2.2 Aβ1-42及PHF-1免疫组织化学染色 10例AD患者海马组织出现较多细胞外SP(图1C)及细胞内NFTs (图1D)。3例老龄对照者出现少量 SP，均为弥散斑；8例对照者均未见NFTs。

注：A．改良Gallyas-Braak嗜银染色显示SP(×200倍)；B. 改良Gallyas-Braak 嗜银染色显示NFTs(×200倍)；C. Aβ1-42免疫组化染色显示SP(EnVision×200倍);D.PHF-1免疫组化染色显示NFTs(EnVision×200倍)。图1 AD患者海马组织CA1区SP及NFTs

2.3 SP、NFTs计数 经改良Gallyas-Braak 嗜银染色显示SP、NFTs 数量与Aβ1-42、PHF-1免疫组织化学染色显示SP、NFTs 数量大致相同，但改良Gallyas-Braak 嗜银染色较免疫组化染色方法显示SP和NFTs 数量稍少。AD组脑组织中SP、NFTs计数结果见表1。

表1 AD组脑组织中SP和NFTs计数个/mm2]

3 讨 论

嗜银染色基本原理是将固定后的切片浸染于银溶液中，再用还原剂处理，使银颗粒沉着于组织中呈现深棕色或黑色。与传统 Bodian 或 Bielschowsky 嗜银染色法不同，Gallyas-Braak 嗜银染色法在浸银前先使用硝酸镧浸泡组织片，不显示正常的神经组织结构，只有异常的嗜银细胞结构才能被显影，有利于观察异常结构。

我们按照文献[3]行Gallyas-Braak嗜银染色，但在AD患者脑组织中无法观察到SP、NFTs，延长物理显影时间，仍不能见到SP、NFTs，且整张切片背景较淡。推测是否为碱性碘化银液常温浸银1 min，不能有效地将银颗粒沉着于组织中。针对该种情况，我们采用退行性染色方法进行染色，即现将组织深染，使其超过所需程度，然后再用分化剂退掉不该着色部分，使该着色部分达到适宜程度。我们对浸银时间和温度进行了改进，选用37 ℃温箱内碱性碘化银液避光孵育1 h，保证银颗粒已沉着于组织中后，再利用分化剂氯化金溶液进行调色，在显影液中显影约20～30 min，密切观察切片变成淡棕色时立即停止显影。经改良后的Gallyas-Braak 嗜银染色能清楚地显示 AD 患者脑组织中的 SP、NFTs，弥散型SP和经典型SP均可见，且背景较干净，有助结果的判定。

我们还对该批标本同期进行了Aβ1-42及PHF-1免疫组化染色并与改良Gallyas-Braak 嗜银染色结果进行对比。结果显示，改良Gallyas-Braak 嗜银染色法和Aβ1-42、PHF-1免疫组化染色均可显示细胞外SP及细胞内NFTs，免疫组化染色更为敏感，显示的SP及NFTs数量较改良Gallyas-Braak 嗜银染色稍多，背景更为清晰。但免疫组化试剂昂贵，操作较复杂，Gallyas-Braak嗜银染色试剂便宜，染色方法简便，与Aβ1-42及PHF-1蛋白免疫组化染色结果基本一致，对某些神经系统变性疾病的病理诊断和研究有很大的帮助,值得开展应用。

在染色应用时体会：(1)为取得良好的染色效果，染色剂硝酸镧液和碱性碘化银液应是新近配制，显影液使用前现用现配。(2)由于脑组织含水分较多，且银染色需要石蜡切片较厚(约8 μm，较易显示轴、树突)，提高银染液的温度，虽然有助于银颗粒沉着，但嗜银染色时间相对较长，很容易掉片，试验中我们分别采用37 ℃温箱内碱性碘化银液避光孵育15 min，30 min，45 min及1 h等不同孵育时间，结果显示，孵育15 min和30 min，经典SP可显示，但较小的弥散SP不易显示；而孵育1 h组织容易掉片；孵育45 min不易掉片，且可染出较小的弥散斑，与免疫组化结果较为一致；(3)氯化金溶液调色及物理显影时间影响异常嗜银结构的阳性率和正常背景结构着色的抑制程度，需密切观察并掌握好显影时间。

[1] Koichi Inoue, Haruhito Tsutsui, Hiroyasu Akatsu, et al. Metabolic profiling of Alzheimer's disease brains[J]. Sci Rep, 2013,3:2364.

[2] Keiko Nakamura,Fumiaki Mori,Tomoya Kon, et al. Filamentous aggregations of phosphorylated α-synuclein in Schwann cells (Schwann cell cytoplasmic inclusions) in multiple system atrophy[J].Acta Neuropathol Commun,2015,3: 29.

[3] 朱明伟,王鲁宁,张笑明.Gallyas-Braak银染色方法在神经组织病变中的应用[J]. 中华病理学杂志, 2001,30(5):384-385.

[4] 朱明伟, 王鲁宁, 刘佳, 等. 神经系统变性疾病的脊髓病理观察[J].中华病理学杂志, 2015, 41(8): 587-593.

[5] 刘东戈,吴浩强,满开泉,等.阿尔茨海默病患者脑组织病理形态学及β-淀粉样蛋白免疫组织化学观察[J].中华病理学杂志,1999,28(6):405-408.

·经验交流·

国家自然科学基金(81260173)

R749.1+6

B

1000-744X(2016)09-0928-02

2016-04-21)

△通信作者，E-mail：caoying0417@163.com