NF-κB活化在肠缺血再灌注全身多脏器的表达及意义

郑德义 王毅 杜娇 李平洋 肖向阳 程代薇 李自力

（贵州省人民医院烧伤整形科，贵州 贵阳550002）

肠 缺 血 再 灌 注 （intestinal ischemia／reperfusion，II／R）损伤常继发于严重创（烧）伤、休克及危重病患者。II／R促进肠道细菌和内毒素移位，氧自由基损伤、过度或失控的炎性细胞因子和炎性介质的合成及释放，不仅引起肠损伤，而且导致远隔器官如肝、肺及肾脏等多器官损害［1］。失控性炎症反应在II／R损伤病理过程中起重要作用，但其发病的分子机理尚未完全阐明。核因子－κB（nuclear factorκB，NF-κB）主要调控炎性细胞因子基因的转录，NF-κB的活化在急性肝、肺损伤的发生发展中起重要作用［2－3］。内毒素血症、TNF-α、IL-1、缺血／ 再灌注、活性氧等因素都能活化 NF－κB，但是，II／R后全身各重要脏器NF-κB的活化情况目前尚不完全清楚。本研究旨在探讨C57BL／6小鼠在II／R后多脏器损害中NF－κB的活化规律及其可能作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组 10周龄健康雄性C57BL／6小鼠，体质量22～26g，动物随机分为假手术组（S）、缺血再灌注组（II／R）。II／R组按缺血后不同再灌注时间又分为再灌注即刻（0）、0.5h、1h、4h、6h和12h组，每组6只。实验过程符合动物伦理学要求并得到医院伦理学委员会批准。

1.2 模型制备及标本的采集 参照以前实验方法［4］，术前禁食12h，自由饮水，腹腔注入1%戊巴比妥钠（50mg·kg－1）麻醉，仰卧固定、常规0.5%碘伏消毒，经腹壁中线切口入腹腔。外置肠攀温盐水纱布覆盖，暴露左侧腹腔，钝性分离并用无创动脉夹夹闭肠系膜前动脉，假手术组不夹闭，暂时关闭腹腔，皮下注入生理盐水1mL，缺血40min松开动脉夹，肠道血供恢复，缝线关闭腹腔，自由饮水。肠缺血恢复再灌注后相应时间点经麻醉处死小鼠，立即取小肠、肝及肺组织于冰盐水中漂洗，置－80℃深低温冰柜保存。II／R6h，分别取距回盲部5cm回肠、右上肺叶、肝及肾脏组织于10%多聚甲醛固定，待病理学检测。

1.3 病理学检查 回肠、肺、肝脏及肾脏组织常规病理切片，HE染色，光学显微镜下观察组织病理变化。

1.4 EMSA检测肠、肝、肺和肾脏NF－κB活化 组织核蛋白提取EMSA检测方法参照文献［5］，BCA法定量蛋白浓度后，置－80℃保存。探针采用NF－κB一致性的双链寡核苷酸序列（5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3’）（Santa Cruz Bio-technology），5’端以γ-32P ATP（Amersham Biosciences）标记。5μg细胞核提取物与32P标记的 NF－κB双链寡核苷酸探针进行结合反应，室温下与poly-（dI：dC）结合缓冲液孵育20min；配制6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，90V电压电泳后1.5h取出凝胶板、干胶处理，凝胶经保鲜膜覆盖并放入装有X线片的暗盒中，在－70℃放射自显影24h，然后显影、定影。对X线片上电泳带进行密度扫描，NF-κB活性以面积×密度表示。用quantity one图像分析软件处理得出光密度值，与假手术组密度值的比值计算其相对表达量。

2 结 果

2.1 肠、肺、肝脏及肾脏组织病理学改变 假手术组（S组）肠、肺、肝脏及肾脏组织形态正常。II／R后6h肠、肺、肝脏及肾脏发生病理改变，主要表现为回肠黏膜层糜烂、溃疡形成，黏膜下层水肿或变性、坏死，黏膜层、黏膜下层炎性细胞浸润；肺组织充血、水肿，肺间质炎性细胞浸润；肝细胞水样变性、气球样变性，部分有炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞水肿。见图1。

图1 II／R后肠、肺、肝和肾脏组织病理学变化（HE×100）

2.2 肠、肝和肺 NF－κB活化情况 II／R引起肠、肝及肾脏组织NF－κB活化。与假手术组比较，缺血再灌注肠组织NF－κB持续活化，尤以再灌注4h、6h升高明显（P＜0.01）；在肝脏组织，NF-κB活化表现呈升高—降低—再升高双峰型特点，缺血再灌注0.5h、6h和12hNF－κB活化明显（P＜0.01）；在肺组织，肠缺血期NF－κB即活化，再灌注1h、4h及12hNF-κB活化明显（P＜0.01），表现呈升高—降低—再升高重复活化特点。见图2。

图2 II／R后肠、肝和肺组织NFκB活性变化

3 讨 论

II／R损伤、肠黏膜屏障受损引起的肠源性感染，诱发全身炎性反应，导致肺、肝、肾脏等远隔脏器的损害，是ARDS和 MODS发生的重要原因［6－7］。研究证实，II／R早期，不仅导致肠损伤，而且引起远隔器官肝、肺及肾脏等多脏器损害。目前认为，肠损伤后肠黏膜屏障受损及功能下降促使肠道细菌及内毒素移位、中性粒细胞活化、氧自由基和各种炎性细胞因子的过度合成及释放、炎症反应在II／R损伤病理过程中有重要作用。

NF-κB是调控炎症反应的中枢环节，目前已知NF-κB／Rel家族成员有 Rel A （p65 ）、Rel B、CRel、p105／p50 （NF-кB1）、p100／p52 （NF-кB2）。静息状态下，NF-κB多以p50／p65异二聚体状态与抑制蛋白IκB相结合而存在于细胞质中，当细胞受到炎性细胞因子、氧化剂、细菌内毒素等多种胞内外信号的刺激［8－9］，细胞质内 NF-κB 结合的IκB 磷酸化、泛化，进而降解并暴露出NF-κB的核定位序列，NF-κB由此转入核内与DNA分子上的κB单元结合，发挥其转录调节功能［10］，从而调控多种炎性细胞因子、黏附分子、趋化因子和生长因子的表达，在机体的免疫应答、炎症反应及细胞增殖和凋亡等方面发挥重要的作用。所以，明确II／R后肠道本身及如肺、肝等远隔器官NF-κB活化规律有重要意义。

本研究结果表明，II／R早期，肠组织 NF－κB活化，肠缺血恢复血流灌注0.5h，肝脏NF-κB达活化高峰，6～12h再次形成活化高峰；在肺组织，肠缺血期 NF－κB活化，再灌注1～4h和12hNF－κB再度明显活化，表现呈升高—降低—再升高重复活化特点。可以认为，肠缺血损伤产生细菌内毒素脂多糖、氧自由基等多种胞内外信号的刺激因素［9］，随血液再灌注进入全身各器官组织，导致肝、肺等器官组织NF－κB活化并与κB序列的DNA结合，启动基因的转录和表达，产生大量炎性细胞因子，参与II／R肝、肺及肾脏等多脏器损害。组织损伤、大量炎性细胞因子如TNF-α、IL-1等以正反馈调节机制刺激NF-κB，进一步激活 NF－кB信号系统，从而形成正反馈的级联放大效应，加剧炎症反应，NF-κB活化成为炎症调控的枢纽和关键。因此，缺血再灌注早期，在产生炎症细胞因子的上游水平抑制或阻断NF-κB的激活通路，可能成为减轻II／R损伤的治疗靶点，值得进一步研究。

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