促红细胞生成素在窒息大鼠复苏后心功能不全的表达及干预作用的研究

黄佳 周厚荣

（1.贵阳医学院，贵州 贵阳550004；2.贵州省人民医院急诊科，贵州 贵阳550002）

心肺复苏本质是全身缺血再灌注损伤，其中复苏后心功能不全是复苏后引起心跳停止的主要原因。随着近年来对促红细胞生成素（erythropoietin EPO）研究的不断深入，相关实验证实EPO对心肌缺血再灌注损伤（mypcardial ischemia and rupufusion，MI／R）具有明显的保护作用［1－2］，包括心肌缺血前、缺血时及再灌注时使用单一剂量的EPO均能产生显著的心肌保护作用［3］。目前未见心肺复苏后EPO表达的报告，EPO对复苏后心功能不全的干预作用亦罕见报道。本实验旨在通过建立窒息大鼠心肺复苏模型，探讨心肺复苏术后各时间点EPO的表达情况及外源性补充EPO对复苏后心功能不全的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 由中医学院实验动物中心提供［许可证号SCXK（渝）2012-0005］健康成年SD大鼠72只。术前晚上禁食，可自由饮水，维持体温正常。随机分为假手术组（S）、常规复苏组（C）、促红素组（EPO）三组，每组分为0h、2h、4h、6h四个亚组，每组6只。0h为术前组，2h、4h、6h为术后组。S组仅进行麻醉、气管切开、血管穿刺，不进行窒息、机械通气以及心肺复苏。C组及EPO组行动静脉穿刺、气管切开、窒息、有创机械通气及心肺复苏。S组及C组于各时间终点采血查EPO水平。EPO组因外源性补充EPO故不查血清EPO水平。

1.2 动物模型制备 根据Hemdrickx等［4］的方法创建心肺复苏模型。具体如下：将S组、C组及EPO组的SD大鼠称重后给予水合氯醛按350mg／kg（3.5mg／100g）腹腔内给药，麻醉满意后将大鼠仰卧于手术台上，作左颈动脉置管，接ASB－240S生物信号采集分析系统（成都傲生科技公司生产）测量 HR、MAP、LVSP、LVEDP、±LVdP／dtmax值。行气管切开，接ALC-V9动物呼吸机（上海奥尔特生物科技有限公司生产），机械通气参数：通气频率80次／min，通气量为6mL／min，I∶E为1∶2，吸氧浓度为100%。以上操作完毕后将SD大鼠置室温下稳定10min，C组及EPO组夹闭气管插管，停机械通气，CA持续240s后立即给予心肺复苏。打开已夹闭气管，给予有创机械通气，相关参数同前。心肺复苏标准：胸外按压频率160次／min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1／3，按压所产生的平均动脉压达35mmHg以上，并快速给予肾上腺素（福州海王福药制药有限公司，规格：1mg／mL）0.02mg／kg（给药容积1mL／kg），3min重复给予肾上腺素静脉给药，经积极心肺复苏15min未成功者放弃复苏。C组给予肾上腺素0.02mg／kg（给药容积1mL／kg＋NS 1mL／kg），EPO组于复苏前给予rhEPO（山东阿华生物药业有限责任公司，规格：4 000IU／kg）5 000U／kg［5］（给药容积1mL／kg）＋肾上腺素0.02mg／kg（给药容积1mL／kg）。实验各时间终点，取血6mL，离心，取上层血清，处死动物。

1.3 心脏停搏（CA）的标准 （1）心电图提示心电静止，心室颤动［6］；（2）心电机械分离；（3）心尖区心脏搏动消失；（4）动物皮肤、黏膜明显发绀；（5）平均动脉压低于20mmHg（1mmHg＝0.133kPa）。

1.4 自主循环恢复（ROSC）判断的指标 （1）心电图出现正常的QRS波群（与夹闭气管前的心电图表现相近）；（2）可触摸到明显的心尖搏动，收缩压不低于60mmHg；（3）动物皮肤、黏膜发绀明显减轻。

1.5 EPO的检测 血清EPO采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定，试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供。试剂在使用前先在室温20～25℃放置15～20min，严格按照说明书操作步骤进行操作，避免误差，设立复孔，取平均值。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。如方差齐，采用成组设计资料的t检验，两两比较用SNK法；如方差不齐，则采用随机区组设计的秩和检验（Wilcoxon检验）；相关性分析采用双变量相关分析，相关系数选用Pearson做双尾检验，P＜0.01示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组实验大鼠之间基本情况比较 各组实验大鼠之间体质量、水合氯醛使用量、肾上腺素使用量、窒息时间、复苏（CPR）时间、自主循环恢复（ROSC）时间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1、表2。

表1 各组实验大鼠基本情况比较（±s，n＝18）

表1 各组实验大鼠基本情况比较（±s，n＝18）

注：组间数据比较差异均无统计学意义（P＞0.05）

组别 体质量（g） 水合氯醛使用量（mg）S组325.50±5.29 115.21±2.48 C组 331.16±4.16 116.44±3.74 EPO组328.41±4.93 114.30±3.18

表2 心肺复苏组实验大鼠基本情况比较（±s，n＝18）

表2 心肺复苏组实验大鼠基本情况比较（±s，n＝18）

注：组间数据比较差异均无统计学意义（P＞0.05）

组别 肾上腺素使用量（μg） CPR时间（s） ROSC时间（s） 窒息时间（s）C组 6.12±0.41 204.50±5.88 625.36±5.63 209.81±4.64 EPO组 6.20±0.22 199.33±4.62 622.73±4.45 210.75±2.780

2.2 心肺复苏后血清EPO水平的变化 S组有创操作术后（2h、4h、6h）EPO水平比较术前（0h）增高（P＜0.01）。C组中2h、4h组与0h组相比较均明显增高（P＜0.01），复苏后6h与0h组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。EPO组因给予rhEPO，检测血清EPO无意义，故未检测。见表3。

2.3 各组间心功能指标变化 各组间心率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与S组比较，C组、EPO组复苏后MAP降低 （P＜0.01）；与S组相比较，C组、EPO组±dp／dtmax及LVSP均下降 （P＜0.01，P＜0.05），C组及EPO组LVEDP均升高（P＜0.01，P＜0.05）；EPO 组各时间点±dp／dtmax及LVSP均高于C组（P＜0.05）；EPO组各时间点LVEDP有所下降（P＜0.05）。见图1－6。

表3 假手术组与常规复苏组EPO水平比较（pg／mL，±s，n＝18）

表3 假手术组与常规复苏组EPO水平比较（pg／mL，±s，n＝18）

注：△与术前0h组比较，P＜0.01；＊与假手术组同时间点比较，P＜0.01

时间（h） 假手术组 常规复苏组0 664.33±218.04648.30±220.04 2 1 737.1±212.32△ 2 717.7±403.51△＊4 1 822.6±221.12△ 1 431.6±486.13△6 1 906.2±323.14△650.3±253.62

2.4 常规复苏后组血清EPO的表达与±dp／dtmax、LVSP及LVEDP的相关性 EPO与±dp／dtmax、LVSP呈显著正相关，r值分别为0.603、0.722、0.765，差异有统计学意义（P＜0.01）；与LVEDP呈显著负相关，r值为－0.920，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

心肺复苏作为挽救生命的重要手段已经历了四十多年的历程，国际心肺复苏及心血管急救指南2000年面世以来至今已经过三次修订，最终目的是为了提高心肺复苏成功率以及降低复苏后并发症的发生率。CPR期间心脏冠状动脉血流锐减，仅为平时血流的20%［7］，有数据显示约有1／3心肺复苏自主循环恢复的患者最终死于心功能不全［8］。复苏后心功能不全是复苏后最重要的并发症，其形成与心肌顿抑有关。

EPO是一种能促进红细胞生成的多肽类激素，一种酸性糖蛋白。近期研究发现EPO是一种重要的细胞保护因子，其生理学作用也由单纯的促进红细胞生成、增加红细胞容量扩展到可以对缺血缺氧性损伤的大脑、肾脏和心脏等多种组织器官起保护作用［9－10］，尤其对心血管系统的细胞保护作用已引起了广泛的关注。EPO改善心功能的作用在多种急性心肌缺血和／或再灌注动物模型中得到证实［11］。江慧琳等［12］对EPO在复苏后心功能不全相关实验中证实EPO可以改善窒息性大鼠心脏骤停—心肺复苏成功后的心功能并减轻心肌损伤。Doue等［13］相关实验发现再灌注后单剂量EPO可以抑制心功能下降。Cai等［14］在缺血再灌注相关实验中观察到EPO可抑制心肌细胞凋亡及改善心功能，由此可见，EPO可能通过抗凋亡改善心功能。

本实验结果显示假手术组2h、4h、6hEPO较术前升高（P＜0.01），其原因可能与下丘脑—垂体—肾上腺皮质系统以及交感—肾上腺髓质系统有关，也与血中ACTH浓度迅速增高、糖皮质激素的生成增多及L茶酚胺量相应增加有关，表明重大创伤应激可刺激机体产生内源性EPO，属机体保护机制。常规复苏组EPO呈先增后降趋势，且复苏后2h水平高于假手术组（P＜0.01）。其原因推测与缺氧后细胞内的自由基活性氧（ROS）增多，引起EPO表达增加［15］有关。同时，肾上腺素刺激内源性EPO的表达增加［16］。随着再灌注时间延长，超过其代偿极限，肾上腺素作用消退，从而导致EPO的表达下调。相关性分析提示心肺复苏术后血清EPO与±dp／dtmax、LVSP均呈正相关，与LVEDP呈负相关，差异均有统计学意义（P＜0.01）。提示内源性EPO的消耗可能是引起复苏后心肌功能不全的发病机制之一。本实验还通过复苏术后补充外源性EPO发现：EPO组复苏后±dp／dtmax、LVSP、LVEDP值均高于C组同时间点，差异有统计学意义（P＜0.05），提示给予rh-EPO后可改善心肺复苏后心功能，与文献报道相符合。其机制可能是通过STAT-5下调促凋亡蛋白基因如Bax和Caspase-3等基因的表达，发挥抗凋亡作用［17］。另外，C组EPO值于复苏后6h降至复苏前EPO水平，可作为静脉补充EPO的实验依据。

综上所述，重大创伤应激可促使血清中EPO在短期表达增高；内源性EPO大量消耗可能是复苏后心功能不全的发病机制之一；外源性补充EPO可明显改善复苏后心功能不全，但其改善心肌功能的作用是否与肾素—血管紧张素系统有关，有待进一步实验研究证实。

［1］ Cai Z，SemenzaGL.Phosphatidylinositol-3-kinase sirgnaling is required for erythropoietin-mediated acute protection against myocardial ischemia／reperfusion injury［J］.Circulation，2004，109（17）：2050-2053.

［2］ Parsa CJ，Kim J，Riel RU，et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart：a potential role for cardiac fibroblasts［J］.J Biol Chem，2004，279（20）：20655-20662.

［3］ Lipsic E，Van der Meer P，Henning RH，et al.Ti ming of erythropoietin treatment for cardioprotection in ischemia／reperfusion［J］.J Cardiovasc Pharmaclo，2004，44（4）：473-479.

［4］ Hendrickx HH，Rao GR，Safar P，et al.Asphyxia cardiac arrest and resuscitation in rats：I Short term recovery［J］.Resuscitation，1984，12（2）：97.

［5］ Christine LK，Shan PingYu，Ling Wei，et al.The Effect of Recombinant Human Erythropoietin on Nenrovasculature Repair after Focal Ischemic Stroke in Neonatal Rats［J］.JEPT，2007，322（2）：521-528.

［6］ Lurie KG，Yannopoulos D，Mcknite SH，et al.Comparison of a 10-breaths-per-minute versus a 2-breaths-perminute strategy during cardiopulmonary resuscitation in a porcine model of cardiac arrest［J］.Respir Care，2008，53（7）：862-870.

［7］ Duggal C，Wei MH，Gazmuri RJ，et al.Reginal blood flow during closed-chest cardic resusction in rats［J］.J Appl Phsiol，1993，74：147-152.

［8］ 周厚荣，张谦，刘海健，等.血必净对窒息大鼠复苏后心功能不全影响的实验研究［J］.贵州医药，2010，34（3）：195-198.

［9］ Ferrario M，Massa M，Rosti V，et al.Early haemoglobin-independent increase of plasma erythropoietin levels in patientswith acute myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2007，28（15）：1805-1813.

［10］ Brines ML，Ghezzi E，Keenan S，et al.Erythropoietin crosses the biood-brain barrier to protect against experimental brain injury［J］.Pro Natl Acad Sci USA，2000，97（19）：10526-10531.

［11］ Moon C，Krawczyk M，Paik D，et al.Cardioprotection by recombinant human erythropoietin following acute experimental myocardial infarction：dose response and therapeutic window［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2005，19（4）：243-250.

［12］ 江慧琳，孙明.复苏后心功能不全［J］.现代临床医学生物工程学杂志，2005，11（2）：85.

［13］ Doue T，Ohtsuki K，Ogawa K，et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in ratssubjected to ischemia-reperfusion injury：assessment of infarct size with 99mTc-armexin［J］.J Nucl Med，2008，49（10）：1694-1700.

［14］ Cai Z，Manalo DJ，Wei G，et al.Hearts from rodents exposed to intermittent hypoxiaor erythropoietin are protected against ischemia-reperfusion injury［J］.Circulation，2003，10（8）：79-85.

［15］ Gossmann J，Burkhardt R，Hartier S，et al.AngioteasiaII infusion increaese plasma erythropoletin levels via Bn angiotensinⅡtype l receptor＿dependent pathway［J］.KidneyInt，2001，60（1）：83-86.

［16］ 唐万春，孙士杰.心肺脑复苏急性脑血管急诊－－从基础科学到临床实践［M］.北京：北京科学技术出版社，2008：47-48.

［17］ Chen X，Chen Y，Bi Y，et al.Preventive eardioprotection of erythropoietin against doxorubicin-induced cardiomyopathy［J］.Cardiovase Drugs Ther，2007，21（5）：367-374.