阻断Hedgehog信号通路对HepG2.2.15细胞增殖的影响

沈璇 黄继锦 张雪 范芳 李长福

（遵义医学院生化教研室，贵州 遵义563099）

Hedgehog是编码一系列分泌蛋白的基因家 族，最早是在果蝇胚胎体中被发现［1］。Hedgehog信号通路是一种非常保守的经典的信号通路，在胚胎的细胞生长和分化过程中起重要的作用［2］。细胞的生长与增殖受Hedgehog信号通路控制，而细胞生长增殖的失控则是肿瘤发生的一个过程。在人类细胞中，Hedgehog信号转导通路由Hedgehog配体、Patched蛋白受体、Smothened跨膜受体、转录因子Gli等关键成分构成［3］。目前大量的研究表明，Hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤发生有关，抑制该通路的药物已用于治疗肺癌等肿瘤，Hedgehog信号通路对肿瘤发生发展的分子机制已成为研究热点。研究发现，Hedgehog信号通路可能通过激活肝癌细胞中下游靶基因异常表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭、自噬、抗辐射等肝癌形成及发展过程［4］。近来，Arzumanyan等［5］发现HBx蛋白可反式激活肝癌细胞的Shh信号通路，其表达水平与Gli2密切相关。Kim等［6］发现HB x蛋白能通过相互结合的方式增强Gli1的稳定性和转录活性，并与Gli1的核定位有关。Hedgehog信号通路与HBV密切相关，但对于它们是否协同调节HBV相关肝癌细胞的增殖、迁移等过程，目前仍未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2.2.15细胞株（中国典型培养物保藏中心），DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），PCR引物由上海生工合成。实时荧光定量PCR试剂盒（TakaRa公司），EDU检测试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司）。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 MTT法检测细胞增殖情况 细胞以1×105个／mL浓度种于96孔板中，培养24h，同步化24h，边缘用灭菌PBS填满。分别用含5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L浓度环耙明的完全培养液作用，孵育24h、48h及72h后加入20μL 浓度5mg／mL的MTT溶液继续培养4h，然后终止培养，吸去培养基，加入150μL DMSO，置摇床上低速震荡10min，待结晶溶解。酶标仪OD490nm处检测各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、DMSO）、对照孔（脂质体处理组、质粒空载体处理组），每组做3个平行。

1.2.2 EDU法检测细胞DNA合成情况 实验分组同上，用5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L浓度环耙明处理24h、48h及72h后，加入含有EDU试剂的培养基孵育2h。去培养基，加入细胞固定液（4%多聚甲醛）室温脱色摇床孵育30min后用PBS溶液漂洗3次，滴加0.5%Triton X-100浸泡细胞，染色反应液500μL，常温避光条件下孵育30min，加Hoechst染料后再孵育30min，PBS冲洗3次，风干后封片。倒置荧光显微镜下拍照后统计DAPI标记的总细胞数和EDU标记有DNA合成的细胞数，DNA合成率 ＝EDU标记有DNA合成的细胞数／DAPI标记的总细胞数×100%。

1.2.3 Real-time PCR法检测细胞 Gli1mRNA 表达情况 实验分组同上，细胞处理48h后，收集各孔细胞，用Trizol法提取RNA，在37℃15min，85℃5s条件下反转录成cDNA。再将cDNA进行 Real-time PCR，引物如下。Gli1上游引物：5′-CA-GCTAGAGTCCAGAGGTTCAAGAG-3′，下游引物：5′-GTGAGTAGA-CAGAGGTTGGGAGGT-3′，扩增片段长度为108bp。β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-ACGAAGATCCGCCTG - ATACTGAATC-3′，扩增片段长度为232bp。经Real-timePCR反应仪器检测，在扩增效率相同的基础上，通过公式2－（△△CT）计算得到目的基因相对表达量。

1.2.4 统计学分析 以上实验均重复3次，结果以均值±标准差（±s）表示。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，资料经正态性及方差齐性检验后，行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验法。P＜0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HepG2.2.15细胞培养

HepG2.2.15细胞培养24h，用倒置显微镜观察并拍照。低倍镜下可见细胞贴壁生长，且成片地“抱团”生长，形态通透、舒展呈多边形或梭形（图1A）；高倍镜下可见胞质内有许多空泡状病毒颗粒（图1B）。

图1 A 低倍镜下（40×）Hep G2.2.15细胞

图1 B 高倍镜（100×）Hep G2.2.15细胞

2.2 MTT法检测细胞增殖

MTT结果（表1，图2）显示：5μmol／L浓度组各个时间段与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；15μmol／L浓度组在48h后与空白对照组存在差异（P＜0.05），48h、72h的生长抑制率分别为79.62%、75.10%；25μmol／L 浓度组的细胞生长抑制率在24h、48h及72h分别为68.9%、31.76%、23.66%，与空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；在各个时间段内，环耙明浓度越高，HepG2.2.15细胞活率越低。

表1 不同浓度环耙明处理后HepG2.2.15细胞的增殖情况（±s，n＝3）

表1 不同浓度环耙明处理后HepG2.2.15细胞的增殖情况（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

组别24h 48h 72h空白照1.241±0.028 1.757±0.1295 1.695±0.100 5μmol／L 1.290±0.058 1.494±0.1366 1.580±0.057 15μmol／L 1.205±0.065 1.399±0.075＊ 1.273±0.06＊25μmol／L 0.845±0.139 0.5583±0.028＊ 0.401±0.079＊

图2 不同浓度环耙明处理后HepG2.2.15细胞的增殖情

2.3 EDU法检测细胞DNA合成情况

结果（图3）显示，DNA合成百分比5μmol／L浓度组在72h后与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；15μmol／L浓度组在48h及72h与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；25μmol／L浓度组在24h、48h及72h时间点上均低于空白组 （P＜0.05）。由实验结果可知，环耙明能在较高浓度时抑制细胞的DNA合成。

图3 各组HepG2.2.15细胞的DNA合成

2.4 Real-timePCR检测Gli1mRNA表达情况

Real-timePCR结果（表2，图4）显示：随着环耙明浓度的增加，Gli1mRNA的表达逐渐降低，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），各组间差异也具有统计学意义（P＜0.05），说明环耙明在HepG2.2.15细胞中具有剂量效应。统计发现，Gli1mRNA表达水平的Pearson相关系数为98.8，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组HepG2.2.15细胞的Gli1 mRNA表达（±s，n＝3）

表2 各组HepG2.2.15细胞的Gli1 mRNA表达（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

分组 β-actin（Ct value）Gli1（Ct value）Fold Change（2－△△Ct）空白组17.95±0.047 34.502±0.211 1.000±0.000 5μmol／L 17.224±.143 34.792±0..078 0.496±0.028＊15μmol／L 17.365±0.087 35.287±0.106 0.388±0.022＊25μmol／L 17.323±0.079 35.918±0.102 0.243±0.018＊

图4 不同浓度环耙明处理组细胞Gli1mRNA相对表达量

3 讨 论

原发性肝癌在恶性肿瘤中发病率位居全球第三位，死亡率居第二位，严重威胁人类的身体健康［7］。目前，对肝癌治疗的手段中，针对肝癌发病机制中关键分子进行分子药物靶向干预的生物治疗展现了良好的前景。

Hedgeheg信号通路与肿瘤的分化及抗凋亡、迁移等发病机制有着密切的关系。在临床治疗中，使用Hedgehog信号通路抑制剂作为药物治疗已经成为一种重要的辅助手段［8］。在体外实验研究中，沉默Hedgehog的方法很多，其中使用环耙明阻断Hedgehog信号通路已被广泛应用［9－12］。因此，本实验在表达HBV的HepG2.2.15细胞中用一定浓度环耙明阻断Hedgehog信号通路；用MTT及EDU检测肝癌细胞的增殖能力。MTT实验结果显示，随着环耙明浓度的提高，HepG2.2.15细胞活性逐渐降低，其中25μmol／L浓度环耙明处理组与空白组各时段差异均有统计学意义（P＜0.05）。EDU实验结果显示25μmol／L浓度环耙明处理组的DNA合成率在各个检测时间点上均低于对照组。MTT的结果与EDU法得出环耙明对HepG2.2.15细胞增殖的影响基本一致，提示Hedgehog信号通路参与了对 HepG2.2.15细胞增殖的调节过程。在HepG2.2.15细胞中，抑制 Hedgehog信号通路的活性能降低细胞的增殖能力，其机制可能与HepG2.2.15细胞中Gli1的表达水平下降有关。Hedgehog信号通路对肝癌的发生发展发挥了重要作用，其高活化程度与肝癌恶化及预后差有着紧密的联系。肝癌发生机制十分复杂，找出Hedgehog信号通路活化的原因十分必要，对其作进一步深入研究，将给肝癌的治疗提供必要的理论依据。

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