脐血干细胞移植对严重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蒋智 贾中申,2 韦方,2△ 李安杰 周永刚 梁青龙 周松

(1.贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳，550002；2.贵州医科大学，贵州 贵阳，550004)

·论 著·

脐血干细胞移植对严重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蒋智1贾中申1,2韦方1,2△李安杰1周永刚1梁青龙1周松1

(1.贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳，550002；2.贵州医科大学，贵州 贵阳，550004)

目的 研究异体脐带血干细胞(UCBSC)移植对严重冠心病患者左心室重塑的作用。 方法 将40例冠状动脉造影为三支血管弥漫病变的冠心病患者随机分为对照组和UCBSC组，均给予常规内科药物治疗，UCBSC组在此基础上经冠状动脉前降支移植UCBSCs。移植前、移植后48 h、4周、12周分别检测血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前胶原氨基末端前肽(PCⅢNP)和血管内皮生长因子(VEGF)水平，用心脏超声检测左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)和左室射血分数(LVEF)值。结果 UCBSC组患者均未发现过敏反应及移植相关不良反应。与对照组及移植前相比，UCBSC组在移植后48 h血清VEGF水平显著升高(P<0.01)，血浆PICP、PCⅢNP水平降低(P<0.01)，且VEGF变化与PICP、PCⅢNP呈负相关(P<0.01)。移植后12周，UCBSC组LVESd小于对照组(P<0.05)，但LVEF差异无统计学意义。结论 严重冠心病患者经冠脉移植异体UCBSCs安全有效，通过上调VEGF表达可抑制心脏纤维化，从而改善左室重塑。

冠心病； 脐带血干细胞； 异体移植； 胶原； 心室重塑

冠心病已成为严重危害我国人民生命健康的疾病[1]。稳定型心绞痛患者冠状动脉造影约有10%为三支血管病变，其中部分严重弥漫性病变患者介入或搭桥手术风险极高。心脏长期慢性缺血可引起心肌细胞间基质纤维化，导致心脏扩大、心功能不全，被称为缺血性心肌病[2]。动物研究发现，脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cell，UCBSC)经静脉移植可上调家兔心肌血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平，从而促进血管新生[3]。VEGF不仅可促进内皮细胞增殖、迁移形成新生血管[4]，还与细胞外基质的胶原代谢密切相关[5]。我们推测UCBSCs移植治疗缺血性心肌病可通过提高VEGF表达水平改善心室重塑，因此本研究纳入严重弥漫性三支血管病变的冠心病患者，经冠状动脉移植UCBSCs，观察其对血浆血管内皮生长因子(VEGF)、Ⅰ型前胶原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前胶原氨基末端前肽(PCⅢNP)表达及左室大小和射血分数等指标的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2009年1月至2010年12月我科住院的冠心病患者40例，所有患者经冠状动脉造影证实为三支血管弥漫性病变，均无介入手术及冠脉搭桥指征。男28例，女12例，年龄51～78岁，随机分为对照组和UCBSC组，均给予常规内科药物治疗，UCBSC组在此基础上通过冠状动脉前降支移植UCBSCs。两组年龄、性别、肾功能、合并高血压、糖尿病及基础心功能情况差异无统计学意义(表1)，均服用阿司匹林、ACEI或ARB、β-受体阻滞剂、他汀类、硝酸脂类和利尿剂等药物，并排除严重肝肾功能不全、慢性阻塞性肺病、恶性肿瘤和血液系统疾病。该研究方案通过本院伦理委员会批准，所有患者均同意接受异体UCBSCs移植并签署知情同意书。

表1 入选患者基本情况

1.2 人脐血单个核细胞的提取与制备

所有脐带血均采自贵州省人民医院妇产科无妊娠并发症、身体健康、新生儿足月分娩(37～40周)的孕妇，均自愿捐献，同意用于科学研究和临床治疗。用一次性血袋采集脐带血80～120 mL，6 h内用1.077 g/L Ficoll密度梯度离心分离法分离，吸取中间单个核细胞层，反复PBS漂洗，220 μm滤网过滤去除细胞团块，最后用20 mL肝素盐水(20 U/mL)制成单个细胞悬液，30 min内用于移植，移植前台盼蓝染色计数活细胞。

1.3 脐血单个核细胞移植

患者取平卧位，常规消毒铺巾，2%利多卡因局部麻醉。右桡动脉穿刺建鞘，通过指引导管经ATM导丝(泰尔茂，日本)将非快速交换球囊(over-the-wire，强生，美国)送至左前降支。退出钢丝，4～6 atm充盈球囊，经球囊中央孔将UCBSCs单细胞悬液缓慢推注。全程监测心率、血压、血氧饱和度。

1.4 血VEGF、PICP、PCIIINP检测

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周取外周静脉血6 mL(早晨空腹时采血,静置30 min, 3 000 r离心10min,收集上清，-80 ℃保存)，检测VEGF、PICP、PCIIINP浓度。VEGF试剂盒购自深圳晶美生物制品有限公司，PICP、PCⅢNP试剂盒购自大连泛邦化工技术开发有限公司，按照试剂盒说明书操作。

1.5 心脏超声检查

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周行经胸二维心脏超声评估左室舒张末内径(LVEDd)、左室收缩末内径(LVESd)及左室射血分数(LVEF)。

1.6 统计学方法

检测结果以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS统计软件分析数据。血清VEGF、PICP、PCⅢNP结果组内比较用配对t检验，组间比较用独立样本t检验，VEGF和PICP、PCIIINP用Pearson积矩相关系数(r)进行相关性分析，LVEDd、LVESd和LVEF用双因素方差分析，P<0.05 示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 UCBSCs移植一般情况

UCBSC组每位患者接受移植的细胞总量为(5.23±2.47)×108，移植前细胞存活率为(96.1±2.3%)，移植后患者住院观察48 h，之后随访12周，未发现过敏反应及移植相关不良反应。

2.2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的变化

对照组各时间点血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平差异无统计学意义。与对照组及移植前比较，UCBSC组VEGF水平在移植后48 h显著升高，而PICP和PCⅢNP水平明显降低(表2)。移植后4周和12周，UCBSC组指标较移植前及与对照组比较差异无统计学意义。

表2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的变化

2.3 VEGF与PICP、PCⅢNP的关系

移植后48 h血清VEGF与PICP、PCⅢNP呈负相关(r=-0.696、-0.775,P<0.01)，说明UCBSCs移植上调VEGF表达的水平与抑制纤维蛋白合成的程度呈负相关。

2.3 心脏左室内径及射血分数的变化

对照组LVEDd和LVESd值随时间延长逐渐增加(P<0.01)，EF值逐渐降低(P<0.01)，提示慢性缺血引起左室重塑、心功能降低。与对照组比较，尽管UCBSC组移植后12周的LVEDd和LVEF值差异无统计学意义，但LVESd小于对照组(P<0.05)，提示UCBSCs移植改善了心室重塑。

表3 不同时间点两组患者左室直径及射血分数变化

注：与同时间点对照组比较，*P<0.05。

3 讨 论

3.1 异体干细胞移植策略的价值

干细胞移植通过“旁分泌效应”促进受损心脏修复具有巨大的潜力[2-6]。已报道的临床试验大多移植自体干细胞[7]，虽然避免了免疫排斥反应，但存在以下不足：首先，每个患者都要获取自身靶细胞并体外培养增殖，可能错过疾病治疗最佳时间窗；其次，缺血性心肌病患者通常合并高龄、糖尿病、高血压、高脂血症等多种伴随疾病，严重削弱自体干细胞的治疗潜力[8]。因此，学术界提出异体干细胞移植策略，即储备年轻健康人群来源的高质量干细胞以“现货”形式供给临床使用，可节省大量人力物力，有利于扩大干细胞治疗的规模从而使更多患者受益[9]。UCBSCs来源丰富，具备取材方便、免疫原性低、有多向分化潜能等优点，是近年来倍受瞩目的理想“现货”种子细胞之一[10]，现已建立起大型UCBSCs库。免疫排斥反应是异体移植最大的风险，我们在患者UCBSCs移植后住院观察48 h，每月随访，均未发现明显过敏反应或移植相关不良反应。

3.2 UCBSCs移植改善心室重塑

心脏基质主要成分是Ⅰ型和Ⅲ型胶原，在心室重塑过程中，心脏胶原总量增加，Ⅰ型胶原含量增加，Ⅲ型胶原含量减少，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值升高[11]。血清PICP和PCⅢNP水平能较好地反映心肌间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成水平，是反映心脏纤维化活动程度的指标[12]。有文献[13]报道VEGF表达水平与肝脏纤维化程度呈正相关，但我们的前期研究[14-15]发现经冠状静脉窦逆行灌注VEGF蛋白可改善内皮功能，促进心肌梗死区血管新生，抑制心室重塑，减少心肌梗死面积，改善左室功能。这说明VEGF在不同脏器纤维化进程中的作用不同：在肝纤维化中VEGF可能促进内皮细胞增殖形成假小叶加重纤维化；而在心肌纤维化中VEGF可能促进血管新生改善心肌灌注从而抑制纤维化。本研究发现，HCBSCs移植后48 h可明显降低血浆PICP和PCⅢNP水平，且下降程度与VEGF升高程度呈负相关，提示HCBSCs通过上调VEGF的表达可抑制心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原合成。移植后4周 UCBSC组患者血清VEGF、PICP和PCⅢNP即恢复到移植前水平，故我们认为UCBSCs移植早期已通过促进血管新生减轻基质纤维化，并且除上调VEGF表达外UCBSCs还可能通过其它机制改善心室重塑。移植后12周UCBSC组患者LVESd值明显低于对照组，进一步说明UCBSCs移植改善了心室重塑。至于12周时两组患者LVEF差异无统计学意义，我们认为一方面可能因为入选例数不足，观察时间过短，不足以显示UCBSCs移植的效应；另一方面，因缺血性心肌病患者心脏扩大、室壁运动不协调，评估心脏腔室大小存在误差[16]，导致数据离散度较大。这些问题有待在今后的研究设计中进一步改进。

总之，严重冠心病患者经冠状动脉移植异体UCBSCs安全有效，UCBSCs移植可通过上调VEGF表达水平抑制心脏纤维化并改善左室重塑。UCBSCs作为“现货”干细胞产品治疗冠心病具有诱人的发展前景。

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Transplantation of umbilicalcord blood stem cell attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients

JiangZhi1,JiaZhongshen1,2,WeiFang1,2,LiAnjie1,ZhouYonggang1,LiangQinglong1,ZhouSong1.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China. 2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the effect of intra-coronary transplantation of allogeneic umbilical cord blood stem cells (UCBSC) on left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients. Methods 40 diffused 3-vessel disease patients were randomly divided into control and UCBSC group. Both groups were administrated with routine medications and UCBSC group was transplanted with UCBSCs through left descending artery. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF), carboxy terminal propeptide of procollagen type I (PICP), precollagen type Ⅲ N-peptide (PCIIINP) was measured before, 48 hours, 4 weeks and 12 weeks after UCBSCs transplantation. Left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), left ventricular end systolic diameter (LVESd) and left ventricular ejection fraction (LVEF) were evaluated with 2-D echocardiography. Results All patients in UCBSC group did not show any allergic reaction or transplantation related adverse effect. As compared with pre-transplantation and the same timepoint of control group, serum VEGF concentration increased in UCBSC group at 48 h (P<0.01), however, PICP and PCIIINP concentrations decreased (P<0.01). The VEGF and the PICP or PCIIINP showed negative correlation (P<0.01). The LVESd were larger in control group than that in UCBSC group at 12 weeks (P<0.05), but the difference of LVEDd and LVEF showed no significance. Conclusion It is safe and effective that allogeneic UCBSCs transplantation upregulated VEGF expression,reduced myocardial fibrosis and attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients.

Coronary artery disease； Umbilical cord blood stem cell Allogeneic transplantation; Collagen Remodeling

国家自然科学基金地区科学基金[81460050]，贵州省科技厅贵州省人民医院联合基金[黔科合LS字(2011)014]，贵州省科技厅科学技术基金[黔科合J字(2014)2112号]，贵州省卫计委科学技术基金[gzwkj2013-1-006]

R-33；R542.2

A

1000-744X(2016)02-0115-04

2015-11-05)

△通信作者，E-mail：w13639087323@qq.com