吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠的学习记忆能力及海马内氧化应激的影响

樊有忠 赵珊珊

(1.陕西省商洛市镇安县医院内科，陕西 商洛 711500；2.西安交通大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西 西安 710061)

吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠的学习记忆能力及海马内氧化应激的影响

樊有忠1赵珊珊2△

(1.陕西省商洛市镇安县医院内科，陕西 商洛 711500；2.西安交通大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西 西安 710061)

目的 研究吡格列酮对Aβ25-35所致痴呆大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激反应的影响。方法 侧脑室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型，吡格列酮(40 mg/kg、80 mg/kg)灌胃21 d，次日行Morris水迷宫实验，前5天定位航行训练，第6天进行空间探索实验。行为学实验后第2天麻醉，断头取脑，提取脑组织匀浆，以备ELISA实验。ELISA实验研究大鼠海马内的氧化应激反应。结果 Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠潜伏期较空白对照组明显延长，而穿过平台次数和平台滞留时间缩短。经吡格列酮治疗后，潜伏期显著缩短，穿过平台次数和滞留时间也相应增加。ELISA结果显示，模型组大鼠海马内酶性抗氧化剂GSH-Px和SOD活性较空白对照组明显降低，而脂质过氧化产物MDA含量增加。经吡格列酮治疗后，GSH-Px和SOD活性提高， MDA产生减少。结论 吡格列酮能改善痴呆大鼠的学习记忆能力，其机制可能与对抗海马内的氧化应激反应有关。

Aβ25-35； 吡格列酮； 学习记忆能力； 氧化应激

阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, AD)是一种中枢神经退行性疾病，临床表现为进行性认知功能减退及精神障碍；典型的病理学特征为老年斑和神经原纤维缠结[1]。流行病学调查显示，截至2005年，全球有3 650万人罹患AD，并以每20年增加一倍的速度增长，到2030年，估计患病人数将达到6 500万[2]，这无疑给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。因此，开发新的治疗策略具有重要意义。淀粉样蛋白瀑布级联假说在AD的发病机制中占有重要地位，淀粉样蛋白β(Aβ)沉积是AD的主要发病因素[3]。Aβ引发免疫/炎症反应及神经毒性级联反应，从而引起广泛的神经退行性病变及神经凋亡，导致学习记忆能力减退和认知功能障碍。其次还有能量代谢假说、胆碱能假说和氧化应激假说等。研究发现，氧化应激参与了AD的早期病理变化[4-5]，因此，抗氧化治疗越来越受到重视。吡格列酮(pioglitazone, Pio)是噻唑烷二酮类药，是一种过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ, PPARγ)激动剂，主要用来治疗糖尿病。研究发现，Pio能抑制皮质和海马内星形胶质细胞及小胶质细胞介导的炎症反应，抑制冈田酸制备的痴呆大鼠海马内GSK-3β的表达，减少tau蛋白的过度磷酸化[6]。 但Pio能否对抗痴呆大鼠海马内的氧化应激反应尚未见文献报道。本实验旨在研究Pio对Aβ25-35诱导痴呆大鼠学习记忆和海马内氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 动物喂养及分组

40只SD大鼠，体质量300～350 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。12 h/d光照，温度(25±2)℃，湿度60%～70%，大鼠饲料喂养。经过7 d适应后，随机分为空白对照组、Aβ25～35损伤组、Pio低剂量组(40 mg/kg)、Pio高剂量组(80 mg/kg)四个组。

1.2 试剂及仪器

Pio(纯度>99.0%)购于日本Takeda公司，用时用二甲基亚砜(DMSO，2g/L)(Sigma,美国，纯度>99.9%)配制成混悬液。Aβ25-35(Sigma,美国)用生理盐水稀释成2 mmol/L浓度，置于37 ℃电热恒温培养箱孵育24 h，使之变成凝聚状态。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)购于南京建成制药公司(中国)。Morris水迷宫购于中国上海欣软信息科技有限公司，Chromate酶标仪购于中国北京普天酶标仪。

1.3 动物模型的建立

将大鼠固定在脑立体定位仪上，常规备皮消毒，用手术刀切开表皮，按照脑立体定位仪图谱，找到左侧侧脑室位置钻孔(前囟后0.8 mm，中线左侧旁开1.3 mm，硬脑膜下3.5 mm)，将Aβ25-35缓慢注入侧

脑室，留针5 min；空白对照组注射等量的生理盐水。注射完毕，用凡士林涂抹并缝合伤口，缓慢放回笼中。Aβ25-35注射后进行药物干预，Pio低、高剂量组用Pio灌胃，剂量分别为40 mg/kg、80 mg/kg。空白对照组和模型组等量生理盐水灌胃。连续干预21 d。

1.4 Morris 水迷宫实验

药物干预后第2天进行Morris水迷宫实验，迷宫分为四个象限，将平台放于第四象限，向迷宫内注入水，使水面高于平台1 cm，水温(25±2)℃。前5天进行定位航行实验，使其在120 s内自由游泳，记录逃避平台潜伏期。若在120 s内未找到平台，时间结束后使其在平台上停留10 s。第6天进行空间探索实验，撤掉平台，使其自由游泳，记录穿过平台次数和平台滞留时间。

1.5 ELISA实验

Morris水迷宫实验完成后第2天，水合氯醛(100 g/L,用量为300 mg/kg,i.p.)麻醉大鼠，断头取脑，迅速分离海马组织，放入液氮中，-80 ℃保存备用。取少量海马组织称量，按照组织∶生理盐水=1∶9的比例，用组织匀浆器打碎混匀，制成10%组织匀浆，用紫外分光光度计测组织匀浆浓度，ELISA法检测海马组织内GSH-Px、SOD的活性及MDA的含量。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 Pio对Aβ25-35诱导的痴呆大鼠学习记忆能力的影响

Morris水迷宫结果显示，大鼠侧脑室注射Aβ25-35后，逃避平台潜伏期较空白对照组明显延长，在平台滞留时间明显减少(P<0.01)。经Pio治疗后，大鼠潜伏期缩短,且平台滞留时间也相应增加，其中Pio低剂量组作用更为明显(P<0.01)。见表1。

组 别n潜伏期(S)d1d2d3d4d5平台滞留时间(s)空白对照组1022.43±2.284.92±0.393.42±0.312.50±0.261.56±0.181.27±0.17模型组1030.90±3.25##26.37±2.59##25.58±2.63##14.06±1.38##9.16±1.12##0.51±0.03##Pio低剂量组(40mg/kg)1025.96±2.24**13.55±1.42**10.54±1.37**7.69±0.76**4.67±0.50**0.75±1.03**Pio高剂量组(80mg/kg)1028.76±2.90**18.73±2.02**11.26±1.25**9.95±1.02**9.29±1.11**0.68±1.70**

注：与空白对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

2.2 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内GSH0Px活性的影响

ELISA结果显示，模型组大鼠海马内GSH-Px活性较空白对照组明显降低(P<0.01)，而Pio治疗组GSH-Px活性则增加，其中尤以Pio低剂量组增加显著(P<0.01)。见图1。

注：与空白对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.05。图1 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内GSH-Px活性的影响

2.3 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内SOD活性的影响

ELISA结果显示，模型组大鼠海马内SOD的活性较空白对照组明显降低(P<0.01)；经Pio治疗后，SOD活性较模型组增加，其中以Pio低剂量组增加显著(P<0.01)。见图2。

注：与空白对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.05。图2 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内SOD活性的影响

2.4 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内MDA含量的影响

ELISA结果显示，模型组大鼠海马内MDA的含量较空白对照组明显增加(P<0.01)；经Pio治疗后，MDA含量较模型组减少，其中Pio低剂量组降低更加显著(P<0.01)。见图3。

注：与空白对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.05。图3 Pio对Aβ25-35导致的痴呆大鼠海马内MDA含量的影响

3 讨 论

AD的主要病理学特征是Aβ沉积。研究发现，侧脑室注射Aβ毒性片段可导致大鼠学习记忆能力减退及认知功能障碍，可用于建立研究AD的动物模型[7]。本实验采用侧脑室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型，研究Pio对Aβ25-35引起的大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激的影响。Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠潜伏期较空白对照组明显延长，穿过平台次数和平台滞留时间也相应减少，说明大鼠的学习记忆能力下降，表明模型建立成功。Pio治疗组大鼠的潜伏期较模型组显著降低，且低剂量组效果更佳；同时以Pio干预也增加了痴呆鼠的穿过平台次数和平台滞留时间。

Pio是非胰岛素依赖型糖尿病的主要治疗药物[8]。研究表明，长期使用非甾体类抗炎药物能降低患者AD的发病率，其机制除了能够抑制环氧合酶，还有可能与激活PPARγ受体有关[9]。研究表明，PPARγ激动剂可抑制神经元内诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase, iNOS)的表达[10]。iNOS表达增加可使一氧化氮的产生增多，导致脑内的氧化应激增强，引起神经元死亡[11]。

氧化应激反应参与了AD的早期病理变化[12-13]，自由基是导致神经元凋亡和其它不可逆性病变的主要因素。由于大脑内还原性谷胱甘肽含量低[14]、神经元细胞膜含有大量多元不饱和脂肪酸[15]以及大脑的正常代谢需要大量氧气[16]，大脑极易受到自由基的攻击[17-18]。氧化应激假说可以解释AD的多元化特征及病因。故本研究采用Aβ25-35诱导的痴呆大鼠研究Pio 对痴呆鼠海马内氧化应激的反应。ELISA结果显示，侧脑室注射Aβ25-35可致使大鼠海马内氧化应激反应增强，酶性抗氧化剂GSH-Px和SOD活性降低，脂质过氧化产物MDA含量增加；而Pio治疗组海马内酶性抗氧化剂活性降低，脂质过氧化产物减少，表明Pio能对抗痴呆大鼠海马内的氧化应激反应。

本实验研究了Pio对AD的治疗作用及其可能的机制，为下一步临床试验提供了依据。目前的治疗药物只能缓解AD的临床症状，延缓AD进展，却无法将其彻底治愈。因此，新的治疗理念是防治未病。Pio对AD是否有预防作用，其它PPARγ激动剂对AD是否也有提高学习记忆的能力，我们将在后续的实验中进行研究。此外，新的病因学假说认为AD是一种“Ⅲ型糖尿病”，即发生在大脑内的糖尿病，以糖/能量代谢紊乱为主要特征，进而影响线粒体功能和神经突触的可塑性。那么，Pio作为一种抗糖尿病药物，是否也能通过改善痴呆大鼠大脑内糖/能量的代谢，改善大脑内的胰岛素抵抗，提高痴呆大鼠的学习记忆能力，也有待进一步研究。

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Effects of pioglitazone on learning and memory deficits and oxidative stress in the hippocampus of Aβ25-35induced AD rats

FanYouzhong1,ZhaoShanshan2△.

1.DepartmentofInternalMedicine,ZhenanCountyHospitalofShangluoCity,Shaaanxi711500,China. 2.DepartmentofHumanAnatomyandHistology,SchoolofBasicMedicalSciencesofXianJiaotongUniversity,Xian710061,China.

Objective To study the effects of pioglitazone (Pio) on learning and memory deficits and oxidative stress in the hippocampus of Aβ25-35induced AD rats. Methods Intracerebroventricular injection of Aβ25-35to produce the model of AD. And the rats were administrated with Pio (40, 80 mg/kg, ig.) for 21 days. Morris water maze test was used to test learning and memory ability of the rats. The first 5 days, place navigation test was carried out followed by the spatial probe test on the sixth day. After behavior test, the rats were sacrificed for preparing tissue homogenate. And ELISA was used to measure the activity of GSH-Px and SOD and the level of MDA. Results Morris water maze test showed that the escape latency was prolonged in rats of model group compared to the control group while the number of crossing the platform and time spent on the platform were reduced. After administration of Pio, the escape latency was decreased and the number of crossing the platform and time spent on the platform were increased. Results of ELISA showed that Pio increased the activity of GSH-Px and SOD and decreased the level of MDA in the AD rats. Conclusions Pio could improve the learning and memory ability of AD rats and the mechanism maybe related to attenuating oxidative stress in the hippocampus.

Aβ25-35; Pioglitazone; Learning and memory; Oxidative stress

R-332；R965

A

1000-744X(2016)02-0119-04

2015-07-21)

△通信作者,E-mail: shanshanzhao_1988@163.com