染料木素对脂多糖诱导的人单核细胞与主动脉内皮细胞黏附的影响

周雪冰 姜念 陆红玲 欧刚卫

(遵义医学院生物化学教研室，贵州 遵义 563003)

染料木素对脂多糖诱导的人单核细胞与主动脉内皮细胞黏附的影响

周雪冰 姜念 陆红玲 欧刚卫△

(遵义医学院生物化学教研室，贵州 遵义 563003)

目的 探讨染料木素对脂多糖(LPS)同时诱导的人单核细胞(THP-1)与人主动脉内皮细胞(HAEC)黏附的影响作用。 方法 分别培养THP-1细胞与HAEC细胞，用不同浓度染料木素预处理两种细胞30 min，然后用LPS同时诱导两种细胞4 h，将THP-1细胞加入到HAEC细胞中共培养1 h，用孟加拉玫瑰红法检测THP-1细胞与HAEC细胞黏附情况；用酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清中血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的浓度。结果 LPS能促使THP-1细胞与HAEC细胞黏附，促进 VCAM-1和ICAM-1释放；加入染料木素后，两种细胞的黏附量及VCAM-1和ICAM-1的释放呈浓度依赖性减少(P<0.05)。结论 染料木素对脂多糖同时诱导的THP-1细胞与HAEC细胞的黏附有抑制作用。

染料木素； 脂多糖； 人单核细胞； 人主动脉内皮细胞； 黏附

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是一个慢性炎症过程[1]。在As的发病机制中，一个关键的早期事件是炎性因子诱导的内皮细胞直接损伤，使其分泌大量炎性介质，导致单核细胞与内皮细胞相互黏附，随后转移到内皮下[2]。此外，炎性因子还可激活单核细胞，使其释放多种细胞因子间接激活内皮细胞，诱导其表面多种黏附因子表达增强，引起内皮细胞间接损伤，最终导致As的发生和发展[3]。染料木素是一种来源于豆科植物的天然生物活性物质，在过去十年中,由于其具有多种生物学活性而引起广泛的关注。研究发现，染料木素具有抑制脂质过氧化、抗炎、保护心血管等作用[4-6]。但目前的研究都仅局限于染料木素对单独培养的内皮细胞的作用，而关于与单核细胞共存体系中内皮细胞的功能状态报道较少。本实验通过建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)同时诱导的人单核细胞(THP-1)与人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cell，HAEC)炎症损伤并共培养的细胞模型，探讨染料木素对共培养条件下THP-1细胞与HAEC细胞黏附的影响，以及血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的激活和表达情况，为进一步阐明染料木素的抗As机制提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LPS购自美国sigma公司；人ICAM-1及VCAM-1定量 ELISA试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司；孟加拉玫瑰红试剂购自北京索莱宝科技有限公司；染料木素购自美国sigma公司，用DMSO溶解配置成母液后储存于-20 ℃备用，使用时以无血清培养基稀释到所需浓度，DMSO终浓度为0.5%。

1.2 细胞来源及培养

HAEC细胞购自美国ATCC细胞库，THP-1细胞购自上海细胞库，两种细胞均由含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养环境为含5%CO2、37 ℃的培养箱，取状态良好、处于对数期的细胞用于以下实验。

1.3 实验分组

实验分为五组：(1)对照组，含无血清培养基；(2)LPS组，用100 ng/mL的LPS分别处理两种细胞4 h；(3)不同浓度染料木素组：高剂量染料木素组(GH)、中剂量染料木素组(GM)、低剂量染料木素组(GL)，将染料木素各组分别加入100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L的染料木素作用30 min后，再与100 ng/mL的LPS作用4 h。

1.4 孟加拉玫瑰红法[7]检测THP-1细胞与HAEC细胞的黏附情况

取生长状态良好的对数期HAEC细胞种于96孔板中，每孔1×104个，培养24 h。待细胞贴壁后，弃去旧培养基，用PBS清洗1次，按上述实验分组加入不同浓度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)的染料木素培养液100 μL/孔，置于培养箱中孵育30 min，吸弃原培养基，加入100 ng/mL的LPS继续培养4 h；同时，选取生长状态良好的THP-1细胞用无血清培养基种于另一96孔板内，每孔3×104个，同样按照要求，加入不同浓度染料木素处理细胞并置于培养箱中孵育30 min后，吸弃原培养基，加入100 ng/mL的LPS继续培养4 h。另设单加空白培养基组以及单加100 ng/mL的LPS组作为对照组。待两种细胞分别孵育4 h后，将THP-1细胞加入到HAEC细胞中，再置培养箱中共孵育1 h。弃原培养基，用无菌PBS每孔清洗1次，去除未黏附的THP-1，每孔加入100 μL 0.25%的孟加拉玫瑰红反应液，室温作用5 min，吸弃染料，用无菌PBS每孔清洗2次，加入终止液(PBS∶无水乙醇=1∶1)200 μL/孔，室温作用30 min后，酶标仪在490 nm波长处测定各孔的光密度值(A值)，A值越大代表黏附量越多。

1.5 酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞培养液中VCAM-1、ICAM-1的释放

将HAEC细胞种于24孔板中，每孔10×104个，培养24 h。待细胞贴壁后，弃去旧培养基，用PBS清洗1次，按上述实验分组加入不同浓度(100 μmol/L、10 μmol/L、0.1 μmol/L)染料木素培养液500 μL/孔，置于培养箱中孵育30 min，吸弃原培养基，加入100 ng/mL的LPS继续培养4 h；同时，选取生长状态良好的THP-1细胞用无血清培养基种于另一96孔板内，每孔3×104个，同样按照要求，加入不同浓度染料木素处理细胞并置于培养箱中孵育30 min后，吸弃原培养基，加入100 ng/mL的LPS继续培养4 h。另设单加空白培养基组以及单加100 ng/mL的LPS组作为对照组。待两种细胞分别孵育4 h后，将THP-1细胞加入到HAEC细胞中，再置培养箱中共孵育1 h。将细胞培养液收集至干净离心管中2 500 r/min离心20 min，再吸取上清液至干净EP管中备用，按ELISA试剂盒的检测步骤逐步操作。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度LPS同时诱导THP-1细胞与HAEC细胞黏附的影响

用10ng/mL、100ng/mL及1μg/mLLPS分别刺激THP-1细胞、HAEC细胞4h后，发现应用100ng/mLLPS刺激细胞黏附最显著，见表1、图1。因此后续试验选择100ng/mLLPS作用细胞。

分 组 THP-1细胞与HAEC细胞黏附(A490) 空白对照组0.139±0.22810ng/mL0.154±0224100ng/mL0.226±0.036*1μg/mLLPS0.175±0.039

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

图1 不同浓度LPS对THP-1细胞及HAEC细胞黏附的影响

2.2 染料木素对LPS同时诱导的THP-1细胞与HAEC细胞黏附的影响

两种细胞分别加入100ng/mLLPS刺激前30min加入不同浓度染料木素预处理后，与单用LPS组比较，随着染料木素浓度的增加，两种细胞的黏附量逐渐减少(P<0.05)。见表2、图2。

分 组THP-1细胞与HAEC细胞黏附(A490)对照组0.162±0.006*LPS0.254±0.020GL0.241±0.020GM0.200±0.019*GH0.174±0.007*

注：与LPS组比较，*P<0.05。

图2 不同浓度染料木素对LPS同时诱导的THP-1细胞与HAEC细胞黏附的影响

2.3 应用ELISA检测细胞培养上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量

与对照组比较，应用LPS同时处理两种细胞4h后，能显著增加细胞培养上清液中VCAM-1、ICAM-1的含量(P<0.01)，与LPS组比较，染料木素呈浓度依赖性地抑制LPS诱导的细胞培养上清液中VCAM-1、ICAM-1的释放。见表3。

分组VCAM-1(μg/L)ICAM-1(ng/L)对照组 786±124**605±79.92**LPS组1116±13.71788±36.16GL组962±92.35**768±20.80GM组840±37.49**699±6.52*GH组804±51.20**628±52.15**

注：与LPS组比较,*P<0.05，**P<0.01。

3 讨 论

大多数研究认为，As从发生发展到转归的全过程就是一个慢性的炎症过程，众多炎症细胞和炎症介质参与其中[8-9]。高血脂、糖尿病、细菌和病毒感染等动脉粥样硬化危险因素均可刺激血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的形成和发展。其中，微生物感染是As发生发展的协同诱发因素之一。LPS作为一种强烈的炎症启动因子可诱导血管内皮细胞损伤，其表达的黏附分子和化学诱导物能促进炎性单核细胞黏附到血管壁而加剧内皮细胞的损伤，引发As的病理生理改变[10-11]。并且LPS还可通过激活单核细胞，使其释放多种细胞因子，引起内皮细胞的间接损伤。血液中的炎性细胞与血管内皮黏附是As早期启动的关键。血液中单核-巨噬细胞与内皮细胞的黏附是前者进入血管壁的前提，而活化的血管内皮细胞黏附分子的高表达是诱导炎性细胞向血管壁黏附和浸润的分子基础。本研究发现，致炎因子LPS能够促进THP-1细胞与HAEC细胞的黏附，且在100ng/mL时作用明显，这与张振等的报道一致。

染料木素又被称为染料木黄酮、金雀异黄素，它具有弱的雌激素效应，在药理剂量时是一个著名的非特异性酪氨酸激酶抑制剂[12]。现有研究表明，染料木素具有抑制脂质过氧化、抗炎、保护心血管等作用。本研究发现，LPS能够促进THP-1细胞与HAEC细胞黏附，而染料木素能够有效抑制LPS诱导的THP-1细胞与HAEC细胞黏附，提示染料木素对单核细胞以及内皮细胞的炎症损伤有一定保护作用。

有研究显示，载脂蛋白E缺陷的小鼠血管内皮易于发生粥样硬化的部位，其VCAM-1、ICAM-1 的表达上调；如将小鼠的单核趋化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1 )或VCAM-1 基因敲除，其粥样硬化病变则明显减少，提示趋化因子或细胞黏附分子在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。而ICAM-1、VCAM-1可促进炎性细胞尤其是单核细胞的迁移与浸润，可吸引大量单核细胞进入内皮下成为泡沫细胞而促进As的发生、发展[13]。本研究发现，经LPS作用后，与对照组相比，细胞培养液中ICAM-1和VCAM-1的含量明显增加。推测LPS可通过激活培养细胞释放黏附分子，促进两种细胞的黏附；而加入染料木素后能够显著抑制LPS同时诱导的两种细胞释放ICAM-1和VCAM-1，且其作用呈浓度依赖性。

综上所述，染料木素能够通过下调ICAM-1和VCAM-1的表达，有效抑制LPS同时诱导的THP-1细胞与HAEC细胞的黏附，这为临床研制预防和治疗动脉粥样硬化的药物提供了依据。但其作用机制有待进一步探讨。

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Effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide

ZhouXuebing,JiangNian,LuHongling,OuGangwei,

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China.

Objective To investigate the effect of genistein on the adhesion of monocytes and endothelial cells induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods After human monocytes (THP-1) and human aortic endothelial cells (HAEC) were pretreated with genistein for 30 minutes and then induced with LPS for 4 hours respectively, the THP-1 cells were co-cultured with the HAEC cells for 1 hours. The adhesion between THP-1 and HAEC was detected by Rose Bengal, and the protein expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the supernatant of the cultured cells were detected by ELISA. Results The adhesion effect between THP-1 and HAEC was increased significantly and the secretion of VCAM-1 and ICAM-1 was raised when the two cell lines were treated by LPS for 4 hours respectively. After administrating with genistein, both the adhesion rate of two cell lines and expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 were reduced in a concentration-dependent manner. Conclusion Genistein can inhibite the adhesion effect of monocytes to endothelial cells induced by LPS.

Genistein; Lipopolysaccharide; Human monocytes； Human aortic endothelial cells； Adhesion

贵州省科技厅联合基金重点项目资助课题[黔科合J字LKZ(2013)14]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0127-04

2015-07-16)

△通信作者