DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖及机制的研究

李大玉 余春波 束波 生欣 李长福 范芳

(遵义医学院生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖及机制的研究

李大玉 余春波 束波 生欣 李长福 范芳△

(遵义医学院生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 检测DNA-PKcs对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖的影响及其相关机制，探讨DNA-PKcs在肝癌多药耐药的发生发展中的作用。方法 采用阳离子脂质体法将siDNA-PKcs转染Bel-7402/5-Fu细胞，cck-8法检测细胞增殖情况；流式细胞技术检测细胞周期；Western blot检测DNA-PKcs、TS蛋白的表达情况。结果 实验组与对照组比较，细胞增殖减少(P<0.05)；实验组S期细胞与对照组比较，细胞数减少(P<0.05)；DNA-PKcs、TS蛋白表达结果显示，实验组相比对照组蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DNA-PKcs的表达沉默能抑制肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu的细胞增殖；其机制可能与沉默DNA-PKcs蛋白表达后， TS蛋白表达下调有关。

DNA依赖蛋白激酶催化亚基； Bel-7402/5-Fu； 细胞增殖； 机制

肝细胞癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一，其起病隐匿，侵袭性强，复发率高的特点决定了化疗在综合治疗中有重要作用，但多药耐药是致使化疗失败的重要原因。DNA依赖蛋白激酶催化亚基(catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)是DNA依赖蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亚单位，参与许多细胞内重要的生物学活动，包括细胞凋亡信号传导、免疫细胞V(D)J重组、免疫细胞分化、基因重组性监视、稳定端粒结构和防止染色体末端融合等[1]。目前关于DNA-PKcs在影响肿瘤耐药的发生发展过程中确切的作用机制和功能还未清楚，现有研究表明DNA-PKcs与肝癌的耐药有关[2]。本研究以siDNA-PKcs转染 Bel-7402/5-Fu肝癌耐药细胞，检测DNA-PKcs沉默后对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖能力的影响，探讨DNA-PKcs在肝癌耐药的发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Bel-7402/5-Fu细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司；siRNA寡核苷酸购于上海吉玛基因生物技术有限公司；Lipofectamine○R2000 Reagent购买于Invitrogen公司；CCK-8检测试剂盒购于美国PeproTech公司；碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)购于凯基生物技术有限公司；DNA-PKcs抗体购买于Assay biotech公司；TS抗体购买于proteintech公司。其它试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将Bel-7402/ 5-Fu细胞培养在含有10%的胎牛血清的1640培养液中，置于37 ℃、5%的二氧化碳培养箱中培养。每天观察细胞生长状态，取对数期细胞用于实验。

1.2.2 分组与转染 分为空白对照组、NC对照组、siDNA-PKcs实验组。细胞接种于培养板中，96孔板按5000个/孔，六孔板按5×105个/孔，融合度达到60%～80%时进行转染。配制siRNA-脂质体复合物，并加入对应孔中，4～6 h换液。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，首先制备成细胞悬液并计数，按5 000个/孔接种于96孔板中，共3块板，分别标明24 h、48 h、72 h，16 h后转染细胞，5 h后弃培养基，按各个时间点，每孔加入10 μL的cck-8，继续培养4 h后，490 nm波长测定其吸光度值。用Graphpad prism5.0软件分析细胞增殖情况。

1.2.4 流式细胞技术检测细胞周期 将细胞接种于6孔板中，12 h后用无血清培养基培养细胞12 h，细胞同步化处理后进行转染，5 h后换液，用含100 ug/mL 5-Fu 的培养基进行培养，48 h后收集细胞，PI单染，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 Western blot检测DNA-PKcs、TS蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，BCA法定量样品蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%BSA封闭1.5 h，一抗孵育过夜(4 ℃)，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h(室温),TBST洗膜3次，ECL发光显色，用ImageJ定量分析软件分析灰度比。

1.3 统计学处理

数据分析采用 Graphpad prism5.0软件包，实验数据以均值±标准差(mean±SD)表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析，P<0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK-8法检测细胞增殖

结果显示，在细胞转染siDNA-PKcs后，细胞培养24 h、48 h、72 h，对照组间细胞增殖无明显差异(P>0.05)；实验组与对照组比较，细胞增殖减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

Groups24h48h72h空白对照组0.352±0.0230.578±0.0250.913±0.106NC对照组0.321±0.0150.561±0.0600.983±0.051siDNA-PKcs实验组0.227±0.0080.419±0.0270.526±0.023

注：*P <0.05；** P <0.01。图1 各组细胞在24h、48h、72h增殖情况

2.2 Western blot检测DNA-PKcs、TS的蛋白表达情况

结果显示，实验组DNA-PKcs和TS蛋白表达下调，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：1为空白对照组；2为NC对照组；3为siDNA-PKcs实验组；*P<0.01。图2 各组细胞DNA-PKcs、TS蛋白表达情况

2.3 流式细胞技术检测细胞周期

结果显示，转染siDNA-PKcs实验组与对照组比较， S期细胞数量减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

注：A为空白对照组；B为NC对照组；C为siDNA-PKcs实验组；*P<0.01。图3 流式细胞技术检测各组细胞周期情况

3 讨 论

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，目前常用手术结合放疗和化疗，但长期放化疗后容易出现多药耐药，这可能与细胞DNA损伤修复能力增强和DNA合成能力有关。然而，临床很多化疗药物均会引起DNA损伤，从而阻碍DNA的生物合成。在哺乳动物细胞中，以DNA依赖蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)为核心组件的非同源重组修复 (non-homologous end joining，NHEJ)途径，在DNA双链断裂的修复中有着非常重要的作用[3-4]。

DNA-PKcs是DNA-PK的催化亚单位，位于染色体8ql1上，相对分子量为470kD，主要包括DNA断裂结合区、催化功能区、Ku结合区三个功能区，属于PI3K(phosphatidylinositol3-kinases，PI3K)家族[5-6]。DNA-PKcs能维持基因组的稳定性并具有肿瘤抑制功能[7]。目前有研究表明，下调DNA-PKcs表达能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[8]。在一些耐药细胞中发现DNA-PKcs表达和活性增加[9-10]，说明DNA-PKcs可能会促进某些肿瘤细胞耐药。另有研究表明，DNA-PKcs 能通过 AKT/GSK3 /c-myc途径 , 调节细胞增殖[11]。胸苷酸合成酶(TS)是 DNA生物合成所必需的，因此，抑制TS就能抑制DNA的生物合成，进而抑制细胞生长、增殖[12]。本实验已通过沉默DNA-PKcs发现耐药蛋白P-gp表达降低和DNA合成减少，因此推测耐药细胞Bel-7402/5-Fu耐药性降低可能与DNA-PKcs沉默所致的P-gp下调和DNA合成减少有关(已发表)。原因可能是DNA-PKcs介入肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复系统和细胞DNA的生物合成，从而调控细胞的增殖。DNA-PKcs在某些耐药细胞中表达增加和活性增强，增加了耐药细胞DNA损伤修复的能力，从而能对抗化疗药物所致的DNA损伤而引起耐药，促进细胞增殖。本实验采用RNAi技术沉默DNA-PKcs的表达，cck-8法检测细胞的增殖能力，结果显示细胞增殖能力减弱。为更进一步说明沉默DNA-PKcs后能抑制细胞增殖，本实验还检测了细胞周期，结果发现S期细胞减少，推测沉默DNA-PKcs后抑制细胞增殖可能是通过影响细胞DNA合成，从而影响其细胞增殖能力。所以，本实验进一步检测肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白的表达情况，结果显示沉默DNA-PKcs后肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白表达明显降低，说明DNA-PKcs沉默能影响细胞增殖，其机制与DNA-PKcs表达沉默后下调TS蛋白的表达有关。DNA-PKcs是否还通过其它机制调控肝癌耐药细胞的细胞增殖，有待进一步的实验观察。

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Study on the effect of DNA-PKcs on the proliferation and the mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular
carcinoma cell line Bel7402/5-Fu

LiDayu,YuChunbo，ShuBo,ShengXin，LiChangfu,FanFang.

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.

Objective To detect the effect of DNA-PKcs on the proliferation of and its mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu, and to investigate the role of DNA-PKcs in the development of multidrug resistance. Methods Transiently was transfected into Bel7402/5-Fu cells via cathodolyte liposome transfection method，and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot (WB) tested protein expression of DNA-PKcs and TS. Results CCK-8 results showed that the experimental group compared with the control group, the cell proliferation was cells in the experimental group was decreased (P<0.05) compared with the control group. WB detection of DNA-PKcs and TS protein expression showed decreased expression of the experimental group than the control group (P<0.05), and there were statistical significantly differences. Conclusion The silence of DNA-PKcs can inhibit decreased (P<0.05). The results of flow cytometry showed that the number of S phase Bel7402 / 5-Fu cell proliferation, and possible mechanism of silencing DNA-PKcs expression after down-regulation of TS protein expression.

DNA-PKcs； Bel7402/5-Fu Cell proliferation; Mechanism

贵州省社发攻关项目[No.(2009)3066]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0131-04

2015-09-19)

△通信作者，E-mail:fanf1970@126.com