Th17细胞相关细胞因子在结直肠癌患者体内的分布及临床意义

袁磊 吴雨岗 王勍 王海涛 钱光阳

(常州市第一人民医院苏州大学附属第三学院胃肠外科，江苏 常州 213000)

Th17细胞相关细胞因子在结直肠癌患者体内的分布及临床意义

袁磊 吴雨岗△王勍 王海涛 钱光阳

(常州市第一人民医院苏州大学附属第三学院胃肠外科，江苏 常州 213000)

目的 探讨结直肠癌(CRC)患者体内Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23的表达情况及其临床意义。方法 选择30例CRC患者和15名健康者为对照，采用实时荧光定量PCR法检测肿瘤组织和正常瘤旁组织中细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23 mRNA表达水平，ELISA法检测外周血IL-17A、IL-23的水平；并作临床相关性分析。结果 肿瘤组织标本中IL-17A的mRNA、IL-23的mRNA相对表达量高于对照组瘤旁组织中的mRNA相对表达量，差异皆有统计学意义(P<0.05)；IL-17F的 mRNA相对表达量低于对照组中的mRNA相对表达量，但两者差异无统计学意义(P>0.05)；外周血IL-17、 IL-23水平均高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。它们与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤发生部位均无关(P>0.05),而与有无淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)。结论 CRC 患者体内存在着细胞因子IL-17A、IL-23的高表达，提示Th17细胞可能参与了结直肠癌的发生发展。

结直肠癌； Th17细胞； IL-17; IL-23

结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是全球范围内困扰人类的常见恶性肿瘤之一，占肿瘤导致患者死亡人数的第三位[1]；尤其是在中国这样的发展中的人口大国，CRC的患病率和死亡率一直高居不下,极大地摧残着患者的生理和心理健康。相关研究发现，结直肠肿瘤发生的重要因素是感染和慢性炎性反应，其中炎性反应与肿瘤的发生发展及疾病的进程密切相关[2]。辅助性17细胞(Thl7)是新近发现的与自身免疫疾病、肿瘤、炎性反应和移植排斥反应相关的细胞群, Thl7细胞分泌的白细胞介素17(IL-17)和白细胞介素23(IL-23)等炎性细胞因子介导了上述过程的发展[3]。本研究通过检测CRC患者肿瘤组织中和正常瘤旁组织Th17相关细胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23表达情况以及比较外周血中细胞因子IL-17、IL-23表达水平，分析它们与临床各项指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

标本来源于2012年10月至2013年4月常州市第一人民医院就诊的30例CRC癌患者,其中直肠腺癌18例，结肠腺癌12例；男性21例，女性9例；平均年龄(65±3.20)岁。实验组相关组织标本均取自手术，所有病例均经病理诊断证实。其中，肿瘤浸润深度在黏膜及黏膜下层3例，固有肌层6例，浆膜及浆膜外21例；并淋巴结转移18例，无淋巴结转移12例；远处转移6例。根据美国肿瘤联合会(AJCC)大肠癌2010年pTNM分期标准进行分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期6例，并分为早期组(Ⅰ期、Ⅱ期)和进展期组(Ⅲ、Ⅳ期)。对照组组织标本均为距肿瘤边缘>10 cm且病理诊断验证无肿瘤浸润的正常瘤旁组织。术前l d清晨空腹抽取上述患者外周静脉血3 mL；另收集15名健康者外周血标本作为对照。所有研究对象均无类风湿、红斑狼疮、慢性溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病史, 无免疫治疗史, CRC患者术前均未接受过任何其它治疗。

1.2 主要试剂

TRIzol○R试剂(Invitrogen by Life Technologies)，逆转录试剂盒(A3500，Promega Corporation)，实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ，Perfect Real Time，Takara Bio，Inc.)；人IL-17 ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc．) ，人IL-23 ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc．) 。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR法检测细胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表达水平 -70℃保存的CRC组织、正常瘤旁组织样本称取100 mg，在预冷的研钵中以液氮充分研磨组织，加入l mL Trizol溶液在玻璃匀浆器中彻底匀浆，室温静置30 min。将匀浆液移至1．5 mL 离心管中，室温静置5 min，按12 000 rpm，4 ℃离心5 min后吸取上清，提取总RNA 并逆转录为cDNA，采用SYBR green 染料法进行实时定量PCR 扩增目的基因。PCR 引物(由上海生工生物工程公司设计并合成)序列，IL-17A：正向引物5’-TTG ATT GGA AGA AAC AAC GAT GA-3’以及反向引物5’-CTC CAG GCT CAG CAG CAG TAg-3’；IL-17F：正向引物5’-GCC GCT CCA CCT CCCC-3’以及反向引物5’-AGA TGT CTT CCT TTC CTT GAG CA-3’；IL-23：正向引物 5’-GTG AGA TGT CAA GAA ACA GGC AAA-3’以及反向引物5’-AGT AAG GTG CCC TGT AGA GAT GGA-3’。PCR 反应条件：预变性95 ℃15 s；40 个循环，每个循环95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s。对PCR 产物荧光值以2△△CT方法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.3.2 ELISA法检测外周血中细胞因子IL-17、IL-23水平 将所抽取的外周血标本按3 000 rpm离心10 min后吸取上清于-80℃保存待测，用双抗夹心法分别检测血清中细胞因子IL-17、IL-23水平。操作过程按ELISA试剂盒说明进行，细胞因子浓度用pg/mL表示。

2 结 果

2.1 两组标本中细胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表达水平

实时荧光定量PCR 法检测结果见表1。实验组标本中IL-17A的mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P=0.042)；IL-17F的 mRNA相对表达量低于对照组，但两者差异无统计学意义(P=0.538)；IL-23的mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P=0.047)。

表1 两组标本中Th17细胞相关细胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表达水平

2.2 外周血标本细胞因子IL-17、IL-23的表达水平

ELISA法检测外周血中细胞因子IL-17、IL-23水平的结果见表2。实验组血清IL-17水平高于健康对照组(P=0.032)，IL-23水平高于对照组瘤旁组织培养液上清中的IL-23水平，两组差异皆有统计学意义(P=0.008)。

表2 ELISA法检测外周血IL-17、IL-23的水平

2.3 CRC患者体内Th17相关细胞因子和各项临床资料指标的关系

收集CRC患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤发生部位，有无淋巴结和远处转移及临床分期等相关临床资料，分别分析上述两种方法检测的肿瘤组织中Th17细胞相关细胞因子表达水平与各项临床资料的关系，结果显示肿瘤组织中及血清标本中Th17相关细胞因子表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤发生部位均无关(P>0.05),而与有无淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05),有淋巴结转移者其肿瘤组织及血清中IL-17A、 IL-17F和IL-23表达水平高于无淋巴结转移者，且进展期肿瘤组织及血清中细胞因子表达水平高于早期肿瘤组织。见表3、表4。

表3 肿瘤组织中细胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA相对表达量与临床各指标关系

表4 外周血IL-17、IL-23表达水平和临床各指标关系

3 讨 论

CRC是大肠粘膜上皮在不良饮食因素、炎症刺激或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，从最初的低度不典型增生腺瘤发展到高等级不典型增生腺瘤并最终转化成癌，这个过程伴随着肿瘤发生相关的基因突变积累和分子变化[4-5]。越来越多的证据表明， CD4+T细胞不同的淋巴细胞亚群之间的平衡和它们的细胞因子网络是CRC发生发展的关键因素[6-7]，而其中尤以新近发现的Th17细胞备受瞩目。Th17细胞同样由初始T细胞分化而来，具有独立的不同于Th1型和Th2型CD4+T细胞的分化及发育机制[8]，在许多自身免疫性疾病和慢性炎症疾病中发挥重要免疫调节作用；而越来越多的研究发现，Th17细胞参与了多种肿瘤的发生发展[9-10]。

Th17细胞以表达IL-17而得名，这种新发现的促炎症细胞因子包括6个家族成员—IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D(即IL-27)和IL-17E(即IL-25)、IL-17F[11]。Th17 细胞分泌的细胞因子IL-17及相关细胞因子，通过介导炎症细胞从而发生炎性反应，而 IL-17A和IL-17F可以诱导表达多种趋化因子、促炎因子。IL-17的表达和多种自身免疫性疾病相关，其分化发育过程中受到了转化生长因子-B(transforming growth factor beta，TGF-β)和IL-6以及IL-23、IL-21等细胞因子的调节[12]。IL-23同样是一种十分重要的炎性介质，甚至被认为是肠道炎性反应的始动者，能引起炎性细胞因子级联反应，致使肠道中IL-17、IL-6、IL-22表达水平增高，从而加剧炎性反应[13]；IL-23在Thl7细胞最初的分化过程中并不起作用，它作用于已经分化好的Thl7细胞，在维持Th17细胞的效应方面发挥重要作用，对促进Thl7细胞的存活与扩增是必须的[14]。虽然一致认为Th17细胞在肿瘤的发生发展中起着较为关键的作用，但其所起的作用及机制仍然存在很大争议[15]。在CRC初发阶段，Th17 细胞在肿瘤患者体内可能发挥促炎性反应的作用，起到了一定的抗瘤作用，但随着肿瘤的进一步发生发展，患者机体免疫系统逐步失衡，相关炎性反应逐渐加剧，失控的炎性反应通过IL-6 活化细胞转录因子(如Star3)等途径促进Th17 细胞的增殖分化和细胞因子IL-17、IL-23的分泌，它们继而上调抗凋亡、促生长和促血管生成基因的表达，从而发挥了促瘤的作用[16-18]。

为了探讨Th17细胞相关细胞因子在CRC患者外周血和肿瘤组织中的分布情况以及可能所起的作用，作者通过实时荧光定量PCR法检测CRC患者肿瘤组织中与正常瘤旁组织中IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表达水平，结果显示肿瘤组织中IL-17A和IL-23的mRNA水平均高于正常瘤旁组织，而IL-17F的mRNA水平在两种组织中无差异，这一结果在细胞因子水平上表明，CRC患者肿瘤组织有利于Th17细胞维持活性效应和扩增，且有IL-17A的表达水平增高。同时，我们对它们和各项临床资料指标的关系进行了分析，结果显示Th17细胞相关细胞因子IL-17A和IL-23表达水平与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤发生部位无关，而与有无淋巴结转移及临床分期有关，暗示Th17细胞参与了CRC的免疫病理过程，而高浓度的IL-17A、 IL-23与CRC的预后密切相关。为了更进一步比较并验证Th17细胞相关细胞因子在CRC患者体内相关组织的分布，本研究比较了CRC患者与健康对照组外周血IL-17和IL-23的表达水平。关于Th17细胞相关细胞因子在CRC患者外周血中升高早有报道，本资料中IL-17、IL-23的表达情况与Stanilov等的报道相一致，CRC患者血清中IL-17、IL-23水平明显高于健康对照，并推测患者外周血细胞因子水平升高是由于肿瘤组织产生释放入血而致。我们同样分析了CRC患者外周血中IL-17、IL-23表达水平与各项临床指标的关系，显示IL-17、IL-23表达水平同样只与CRC患者有无淋巴结转移及临床分期有关。

综上所述，CRC患者肿瘤组织及外周血存在着IL-17、IL-23的高表达，提示肿瘤组织确实存在着利于Th17细胞活化扩增和维持效应的因素，其表达的相关细胞因子在CRC的发生发展中起着重要作用。因此，可以将它们作为重要的生物指标用于CRC的诊断与预后；而干预Th17细胞分泌相关细胞因子可能成为治疗CRC的新策略。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A， et a1．Cancer statistics[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians,2013 63(1)：11-30.

[2] Sung JJ, Lau JY, Young GP, et a1.Asia pacific working group on colorectal cancer: asia pacific consensus recommendations for colorectal cancer screening[J]. Gut, 2008, 57:1166-1176.

[3] 何英,郑长青,林艳,等. Th17细胞的生物学效应及研究进展[J]. 现代生物医学进展,2009,(09):1769-1772.

[4] Hsu HC, Yang P, Wang J, et al. Interleukin 17-producing T helper cells and interleukin 17 orchestrate autoreactive germinal center development in autoimmune BXD2 mice [J]. Nat Immunol, 2008, 9 (2):166-175.

[5] 熊波,尹光平,冯连吉.开腹和腹腔镜下直肠癌根治术的疗效分析 [J]. 贵州医药．2014,38(12):1088-1089.

[6] Sallusto F，Lanzavecchia A．Heterogeneity of CIM+memory T cells：functional modules for tailored immunity[J]．Eur J Immun01,2009,39：2076-2082.

[7] 文国容, 庹必光, 刘华庆,等. IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在人结直肠腺瘤和结直肠癌中的表达及意义[J]. 贵州医药,2010,34(12)：1069-1071．

[8] Kroenke MA, Carlson TJ, Andjelkovic AV, et al. IL-12-and IL-23-modulated T cells induce distinct types of EAE based on histology, CNS chemokin profile, and response to cytokine inhibition [J]. Exp Med, 2008,2005(7): 1535-1541.

[9] Wójcik E, Jakubowicz J, Skotnicki P,et al. IL-6 and VEGF in small cell lung cancer patients[J]. Anticancer Res, 2010, 30(5): 1773-1778.

[10] 陈和敏,申婷,游晶, 等. Th17细胞的分化、调节及其主要细胞因子和功能[J]. 现代生物医学进展,2015(01):191-194.

[11] Center MM, Jemal A, Ward E. International trends in colorectal cancer incidence rates[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev ,2009, 18:1688-1694.

[12] Contasta I, Pellegrini P, Berghella AM, et al.Colon cancer and gene alterations: their immunological implications and suggestions for prognostic indices and improvements in biotherapy[J]. Cancer Biother Radiopharm ,2006, 21:488-505.

[13] Wei L, Laurence A, Elias KM, et al. IL-21 is produced by Th17 cells and drives IL-17 production in a STAT3-dependent manner[J]. J Biol Chem, 2007,282(48): 34605-34610.

[14] Cui G, Goll R, Olsen T, et al.Reduced expression of microenvironmental Th1 cytokines accompanies adenomas-carcinomas sequence of colorectum[J]. Cancer Immunol Immunother ,2007, 56:985-995.

[15] 王智勇,傅德杰,倪兵. Treg细胞和Th17细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展[J]. 现代生物医学进展,2013,(09):1790-1792.

[16] Yang XO. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs[J]. Immunity, 2008, 29: 44-56.

[17] Berghella AM, Contasta I, Pellegrini P, et al.Are immunological mechanisms involved in colon cancer and are they possible markers for biotherapy improvement [J]. Cancer Biother Radiopharm, 2006, 21:468-487.

[18] Chang SH, Dong C. A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17and IL-17F regulates inflammatory responses [J]. Cell Res, 2007, 17: 435-440.

Distribution and clinical significance of Th17 cell-associa ted cytokines in colorectal cancer patient

YuanLei,WuYugang△,WangQing,WangHaitao,QianGuangyang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,TheFirstPeople'sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,China.

Objective To explore the expression and clinical significance of Th17-related cytokines IL-17A, IL-17F, IL-23 in colorectal cancer patient (CRC). Methods A group of 50 patients and 15 healthy controls were included in the study. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of IL-17A, IL-17F, IL-23 and the quantitative determination of IL-23, IL-17 serum levels were performed by ELISA. The potential associations between them with the clinicopathological characteristics were analyzed. Results The IL-17A mRNA and IL-23 mRNA expression of tumor tissue samples were(0.02218±0.00549)and(0.00232±0.00478), significantly higher than those of healthy control (P<0.05)．The levels of serum IL-17 and IL-23 of CRC patients were significantly higher than those of the controls (16.39±1.72 vs 7.91±4.74 pg/ml, 68.12±11.22 vs 9.13±6.65 pg/ml (P< 0.05). The increased expression of IL-17A mRNA and IL-23 mRNA, also the levels of the serum IL-17 and IL-23 were not associated with the gender and age of patients with CRC, nor the umor size , tumor site (P>0.05), but associated with the lymph node metastasis and TNM stage (P< 0.05). Conclusion There was a significant increase of Th17 cell-associated cytokines in colorectal cancer patients, which suggests that IL-17 and IL-23 may directly or indirectly contribute to the development and progression of CRC.

Colorectal cancer； Th17； IL-17； IL-23

常州市科技支撑计划基金资助项目[CE20125020]

R735.3

A

1000-744X(2016)02-0135-04

2015-12-04)

△通信作者,Email：wuyugang89@163.com