硫酸软骨素对低营养状态下SH-SY5Y细胞保护作用的观察

刘明海 吴昌学 叶凌 刘杨 陈量 刘艳洁△

(1.贵阳市花溪区人民医院神经内科，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学病理教研室，贵州 贵阳 550004)

硫酸软骨素对低营养状态下SH-SY5Y细胞保护作用的观察

刘明海1吴昌学2叶凌1刘杨3陈量3刘艳洁3△

(1.贵阳市花溪区人民医院神经内科，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学病理教研室，贵州 贵阳 550004)

目的 通过观察硫酸软骨素对体外培养SH-SY5Y细胞株生长状态、细胞生存率和超微结构的影响，探讨硫酸软骨素对脑神经细胞生长促进作用及损害的保护作用。 方法 培养SH-SY5Y细胞，观察正常SH-SY5Y细胞、低营养处理及硫酸软骨素处理SH-SY5Y细胞的形态及细胞活力。用光学显微镜及透射电子显微镜观察各组细胞形态及超微结构改变，用MTT法检测细胞生存率。结果 硫酸软骨素处理组SH-SY5Y细胞较低营养处理组细胞生长状态好，细胞形态完整，低营养处理组存活细胞数量减少，突起减少、变短；电镜观察低营养处理组细胞中内质网、高尔基体及线粒体肿胀呈空泡状，部分细胞破裂成碎片，正常对照组和硫酸软骨素处理组细胞结构完整，内质网、高尔基体及线粒体结构正常；细胞存活率低营养处理组较对照组明显降低，相同培养时间内存活细胞数量较少，而硫酸软骨素处理组较对照组和低营养处理组存活率明显升高，存活细胞数量明显增多。结论 硫酸软骨素可延长SH-SY5Y细胞生存时间，可维持和改善低营养状态下SH-SY5Y细胞形态及生理功能。硫酸软骨素对保护和促进神经细胞生长具有一定作用。

SH-SY5Y细胞； 硫酸软骨素； 细胞生存率； 超微结构

近年研究表明，硫酸软骨素作为细胞外基质中主要的组成成分对细胞的生长及存活具有十分重要的作用。硫酸软骨素作为抗动脉硬化和阿尔茨海默病的辅助药物在临床中也得到应用。硫酸软骨素有缓和的抗凝血作用，在体内与蛋白质形成硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs),CSPGs可减弱β-淀粉样蛋白对海马神经元的破坏作用，并可迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸对神经细胞的破坏作用，增强神经元的活性。脑缺血缺氧引起脑组织及功能损害在临床极为常见。关于硫酸软骨素对脑缺血导致神经细胞损害的保护作用方面的研究较少，本研究旨在通过硫酸软骨素对体外培养SH-SY5Y细胞株生长的影响，探讨其对神经细胞的保护作用，为进一步研究大脑损害的治疗及临床用药提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

培养细胞和培养细胞试剂：SH-SY5Y细胞(购自德国German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司)；DMEM 培养液(购自英国 Gibco Invitrogen 公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)及培养细胞用青霉素—链霉素(购自美国Hyclone 公司；3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT](购自美国Sigma公司)；硫酸软骨素注射液(湖南康普药业有限公司)；H-7650 透射电镜( 日本日立公司 )；ELX 800酶标仪(美国Bio-Tec公司)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞培养 将冻存SH-SY5Y细胞株复苏，并于37 ℃ CO2培养箱中培养，24 h后换培养基(含10%胎牛血清、1∶100双抗的DMEM)继续培养。观察细胞生长状态，待细胞长满培养瓶底传代继续培养。正常对照组细胞用完全培养基(含10%胎牛血清、1∶100双抗的DMEM)培养，低营养处理组细胞用完全培养基(含5%胎牛血清、1∶100双抗的DMEM)培养，硫酸软骨素处理组细胞用0.4 mg/mL硫酸软骨素处理(含5%胎牛血清、1∶100双抗的DMEM)培养96 h以上。

1.2.2 细胞存活数量观察 观察相同培养时间内正常组SH-SY5Y细胞，低营养组细胞和经硫酸软骨素处理组细胞的数量，并进行对比。计数前换液，用0.25%胰酶进行消化5 min，贴壁细胞脱落形成细胞悬液后，用移液器将细胞分散均匀，用血球计数板计数。

1.2.3 MTT实验 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，铺板时使待测细胞密度达1 000～10 000 孔(边缘孔用无菌PBS填充)；5%CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，每孔100 μL，设3个复孔；5%CO2，37 ℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察；每孔加入0.5%MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)、对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

1.2.4 电子显微镜观察细胞处理 PBS清洗细胞两次，刮取细胞并用PBS形成细胞悬液，离心(800～1 000 r/min)获得细胞沉淀，弃去PBS，用电镜固定液重悬细胞，4 °C保存待检。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 细胞生长状态观察

相同培养时间内与对照组比较，低营养处理组细胞生长状态明显下降，细胞数量及细胞突起明显减少；经硫酸软骨素处理的SH-SY5Y细胞生长状态良好，细胞数量多，突起多有分枝并交织成网状。

2.2 细胞生存时间观察

从表1可见，培养72 h后，对照组细胞及低营养组细胞存活率均明显下降，细胞计数存活细胞数量也明显下降；硫酸软骨素处理组细胞存活率较对照组及低营养处理组都明显升高，细胞计数存活细胞数量明显升高。

分 组 细胞存活率细胞计数(×106个/mL)对照组(10%FBS)0.25±0.037.2±1.5低营养处理组(5%FBS)0.05±0.02a2.2±1.3a硫酸软骨素处理组(0.4mg/mL)0.85±0.23ab7.8±1.4ab

注：与对照组相比，aP<0.05；与低营养处理组相比，bP<0.05。

2.3 MTT实验检测各组细胞存活率

从表2可见，细胞经不同浓度硫酸软骨素处理培养72 h后，随着硫酸软骨素处理浓度升高，细胞存活率逐渐升高，当处理浓度达到0.80 mg/mL时细胞存活率未见明显升高。

表2 细胞存活率观察

2.4 电子显微镜观察

从图2可见，细胞经硫酸软骨素处理形态与对照组细胞无明显差异；电镜观察显示，细胞核、线粒体结构清晰，硫酸软骨素处理细胞内吞饮小泡较多。

图2 细胞超微结构观察

3 讨 论

硫酸软骨素是细胞外基质中主要的组成成分，对细胞的生长及存活具有十分重要的作用。CSPGs可减弱β-淀粉样蛋白对海马神经元的破坏作用，迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸对神经细胞的破坏作用，增强神经元的活性。CSPGs能激活胞内蛋白激酶，增加DNA和RNA合成，加速蛋白合成，从而促进海马与神经轴突等神经细胞的生长，修复受损的中枢神经系统，促进神经突起的再生长。因此，硫酸软骨素对受损的脑细胞具有支持存活、延缓死亡、增强修复和再生的能力[1-2]。

以往临床治疗中硫酸软骨素主要用于降血脂、软化血管和抗动脉粥样硬化，随着对细胞外基质作用研究的不断深入，其应用范围也日益广泛，在神经性头痛、神经退行性病变治疗中也取得一定效果。但也有研究表明，在治疗过程中，过度表达的硫酸软骨素会促进角质瘢痕形成，抑制神经元轴突及突触的生长，在神经损害修复中起到了负面作用[3]。所以，对硫酸软骨素在神经损害后作用机制的研究对临床安全用药具有十分重要的意义。研究显示，脑缺血缺氧后神经元中线粒体融合受到阻碍，导致线粒体形态异常及功能障碍[4]。急性缺血大鼠脑皮质神经元内也观察到线粒体、内质网扩张，高尔基体结构不清[5]。我们的研究结果亦显示，低营养处理组SH-SY5Y细胞线粒体、内质网扩张，高尔基体肿胀，而硫酸软骨素处理组细胞超微结构肿胀扩张较少；检测细胞生长状态和活力发现，硫酸软骨素能较好地维持SH-SY5Y细胞生长状态，延长细胞在低营养状态下的生存时间，说明药物对细胞具有一定保护作用。以往研究认为，硫酸软骨素对脑缺血损害的主要作用体现在缓和的抗凝血、溶栓、通栓及改善脑血管微循环方面。研究表明，每1 mg硫酸软骨素A相当于0.45 U肝素的抗凝活性，这种抗凝活性并不依赖于抗凝酶Ⅲ而发挥作用，它可以通过纤维蛋白原系统而发挥抗凝血活性，因此具有溶栓、通栓作用[6]。因此，硫酸软骨素能够改善脑血管的微循环，增加脑组织灌流量，改善脑缺血。作为重要的细胞外基质，它对神经细胞的生存内环境可产生直接影响，本研究结果显示硫酸软骨素对体外培养细胞生长有促进作用，对低营养损害有一定保护作用。但鉴于硫酸软骨素过量表达会抑制神经元生长并形成角质瘢痕，所以将其作为脑损害治疗药物的用量及用药时机还有待进一步深入研究。

[1] Fawcett JW. The extracellular matrix in plasticity and regeneration after CNS injury and neurodegenerative disease[J]. Prog Brain Res ，2015, 218:213-226.

[2] Dyck SM, Karimi-Abdolrezaee S. Chondroitin sulfate proteoglycans: Key modulators in the developing and pathologic central nervous system[J]. Exp Neurol， 2015, 269:169-187.

[3] Kwok JCL, Heller JP, Zhao RR, et al. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury[J]. Methods Mol Biol，2014,1162:127-138.

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[6] 刘武. 硫酸软骨素药理作用研究进展[J]. 中国药业， 2008, 25(8): 125-128.

Observation of protective function of chondroitin sulfate proteoglycans in SH-SY5Y cell treated with low serum medium

LiuMinghai1,WuChangxue2,Yelin1,LiuYang3,ChenLiang3,LiuYanjie3.

1.DepartmentofNeurology,HuaxiDistractPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550004,China. 2.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 3.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the protecting function of chondroitin sulfate proteoglycans in neuron injury, through observing growth state, survival rate and ultrastructure of SH-SY5Y cell line treated with chondroitin sulfate proteoglycans. Methods To observe the difference between normal SH-SY5Y cell and the cell line treated with sulfate proteoglycans and low serum medium, to observe morphology by light microscopy and electron microscopy, to observe survival rate of cell line by MTT. Results The growth of SH-SY5Y cell treated with sulfate proteoglycans was greater than normal SH-SY5Y cell and cell treated with low serum medium. The shorter neurite and decreased amount was observed in SH-SY5Y treated with low serum medium, mitochondrial, golgi and endoplasmic reticulum swelling was observed by electron microscopy, but the impairment of ultrastructure in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans was slighter than SH-SY5Y cell treated with low serum medium. The higher survival rate and amount of living cells was observed in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans than SH-SY5Y cell treated with low serum medium and control. Conclusion The chondroitin sulfate proteoglycans can protect neuron improve survival rate of the neurons and decrease impairment.

SH-SY5Y cell; Chondroitin sulfate proteoglycans; Survival rate Ultrastructure

国家自然科学基金(81260417)；贵州省科技厅贵州医科大学联合基金[黔科合LG(2012)006号]

R392.12

A

1000-744X(2016)02-0146-03

2015-08-05)

△通信作者，E-mail：lyj_liuyanjie@hotmail.com