百里醌通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻肝缺血再灌注损伤的研究

陈志则 夏中元 孟庆涛

(武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060)

·实验研究·

百里醌通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻肝缺血再灌注损伤的研究

陈志则△夏中元 孟庆涛

(武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060)

目的 探讨百里醌对肝缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法 建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型。30只C57小鼠随机分为三组,每组10只,分别为假手术组、缺血/再灌注损伤组和百里醌预处理组。各实验组肝缺血90 min再灌注4h时采血和收集肝脏标本, ELISA法分别检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、炎症因子白介素-6 (IL-6)、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平。Western blottin检测肝组织中JAK2、 STAT3、p- JAK2和 p-STAT3的表达。RT-PCR 检测肝脏TNF-α、IL-6 和IL-1β的表达及HE染色肝组织的病理改变。结果 与假手术组相比，缺血/再灌注损伤组ALT、 AST、 p-JAK2、p-STAT3、 TNF-α、IL-6 和IL-1β的表达和病理改变明显增加，而JAK2和STAT3的表达无明显改变。与缺血/再灌注损伤组相比，百里醌预处理组ALT、 AST、 p-JAK2、p-STAT3、TNF-α、IL-6 和IL-1β的表达和病理改变明显减少，而JAK2和STAT3的表达依然无明显改变。结论 百里醌能减轻肝缺血再灌注损伤，其机制可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻炎症。

百里醌； 肝缺血再灌注损伤； 炎症; JAK2/STAT3信号通路

肝缺血再灌注损伤是临床上常见的危重症，常继发于休克、肝移植、肝脏切除等。 其发病机制复杂，具体机制尚不清楚。研究发现，炎症、凋亡和坏死在肝缺血再灌注损伤中起重要作用[1-2]。百里醌(thymoquinone)是从Nigella sativa植物中提取的一种物质,长期用于治疗哮喘、湿疹、痢疾、头痛等。最近研究发现百里醌具有多种生物学作用，如抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等[3-4]。 而炎症是临床危重症肝缺血再灌注损伤的重要发病机制[5-7]。本研究利用小鼠构建缺血再灌注损伤模型，探讨百里醌对肝缺血再灌注损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和耗材

百里醌 (哈森：上海),无水乙醇 (Sigma：美国)，3%戊巴比妥钠(桥星，上海), HE试剂由湖北省人民医院病理实验室配制。β-actin抗体(Abmart，中国)；JAK2(CST, USA), p- JAK2(CST, USA) ，p-STAT3(CST, USA)， STAT3(CST, USA),β-actin (abgent，USA)；显微镜(Olympus BX51)及成像系统(HITMAS-30)均由医院病理科实验室临床病理组提供。百里醌用无水乙醇溶剂并配制成浓度为1 mol/L的贮存液，-20 ℃冰箱保存。

1.2 动物与造模

30 只雄性C57小鼠，体质量20～25 g，SPF 级, 购自武汉大学实验动物中心，饲养于湖北省人民医院实验动物实验中心,设施使用证明号:014098。适应性喂养1 周后,状态良好, 随机分为假手术(Sham)组、肝脏缺血再灌注损伤(IRI)组和百里醌预处理(thymoquinone)组,每组10只。thymoquinone组术前给予百里醌 (50 mL/kg)腹腔注射,剂量参照文献[6]；Sham 组和IRI 组术前给予等浓度生理盐水腹腔注射;Sham组给予假手术,IRI 组和Thymoquinone组给予肝脏缺血再灌注手术。肝脏缺血再灌注手术方式如下:戊巴比妥钠麻醉状态下,腹正中切口开腹，分离暴露肝门部, 剪断左中肝叶各韧带, 游离左中肝叶的胆管及门静脉、肝动脉分支 。用无创伤血管夹夹闭肝左外叶、肝中叶之门静脉及肝动脉分支,致70%肝脏缺血[8]。阻断后可见被血供阻断区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色提示肝脏缺血成功 ,缺血 90 min 后松夹再灌4 h 形成肝缺血再灌注模型。假手术组操作同上，但不夹闭血管。再灌注4 h后处死小鼠,收集血清和肝脏标本。实验中动物状态较好,苏醒较快,无死亡，术后给予正常饮食饮水。

1.3 血清中ALT、 AST、IL-6、 TNF-α 和 IL-1β水平检测

按照ELISA试剂盒说明书操作步骤，检测血清中ALT、 AST、IL-6、TNF-α 和 IL-1β的表达水平。

1.4 肝脏病理检测

肝脏组织采用10% 多聚甲醛固定,常规脱水浸蜡(Thermo Fisher),石蜡包埋,4 μm切片,脱蜡透明后由病理科实验室HE染色。病理评分：0分为没有损伤；1分为轻微损伤，胞浆空泡变性和局灶性细胞核固缩；2分为中度至重度损伤，具有广泛的核固缩；3分为组织炎症、出血和中性粒细胞浸润及解体严重坏死。

1.5 Western印迹检测

取肝脏组织于精微天平称重，按照每50 mg组织中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上匀浆，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min后取上清，BCA法测定蛋白浓度。以含50μg蛋白质的上样量，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(5 %浓缩胶，10%分离胶，恒压80～100 V)后转膜(PVDF膜,恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脱脂奶粉(TBST配制)封闭1 h，JAK (1∶2000)、 p-JAK2 (1∶1000)、STAT3(1∶1000)、 p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3000)单抗孵育过夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL试剂，Kodak化学发光仪曝光显示目的蛋白并拍照。以Quantity one对条带进行定量分析，以目的条带和β-actin条带积分灰度值比值为结果。

1.6 IL-6、TNF-α 和 IL-1β检测

称取适量肝脏组织，于液氮中研磨成粉末状提取总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录及扩增反应按试剂盒说明书进行。以管家基因β-actin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2-ΔΔCT计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 为实时定量PCR检测的引物序列

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 ALT和AST水平比较

与Sham组相比，IRI组 ALT和AST值明显升高[ALT和AST值分别为(160±12)、(76±11)U/L，而Sham组为(13±2)、(7±3)U/L，P< 0.05 ]。thymoquinone组与IRI组相比，ALT和AST值明显降低[ALT和AST值分别为(90±10)、(30±10)U/L，(P< 0.05)]。提示百里醌预处理可以明显减轻肝脏缺血再灌注损伤。见图1。

图1 百里醌对肝脏缺血再灌注损伤ALT和AST值的影响

2.2 肝脏病理改变

Sham组肝细胞形态正常, 肝血窦区无充血、肿胀，未见炎症细胞浸润，其损伤评分为(1±0.5)；IRI组肝小叶结构大量破坏，肝细胞广泛聚集、坏死，肝血窦区明显充血肿胀，门管区有大量炎性细胞浸润，其损伤评分为(8±2)分(P<0.05)；而thymoquinone组肝小叶破坏，肝细胞聚集、坏死，肝血窦区充血肿胀， 门管区炎性细胞浸润均较IRI组明显减少，其损伤评分为(4±1)分(P<0.05)。见图2。

图2 百里醌对肝脏病理改变的影响

2.3 促炎症细胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β表达的比较

结果显示，IRI组促炎症细胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β水平明显增加(P<0.05)，而thymoquinone组IL-6、TNF-α 和 IL-1β水平较IRI组明显降低(P<0.05)。见图3。

图3 百里醌对促炎症细胞因子TNF-α (A,D)、IL-6 (B,E) 和 IL-1β(C, F)表达的影响

2.4 p-JAK2和p-STAT3、JAK2和STAT3表达的比较

与Sham组相比，IRI组p-JAK2和p-STAT3表达明显上调(P<0.05)，而JAK2和STAT3表达无明显差异(P>0.05)。thymoquinone组与IRI组相比，p-JAK2和p-STAT3表达明显下调(P<0.05), 而JAK2和STAT3表达无明显差异(P>0.05)。提示百里醌预处理可减轻JAK2/STAT3信号通路的激活。见图4。

图4 百里醌对JAK2、 p-JAK2、 p-STAT3和STAT3表达的影响

3 讨 论

肝脏缺血再灌注损伤是肝脏血供中断后，重新恢复血流灌注导致损伤反而进一步加重的肝脏损伤，常见于移植、外伤、肝脏切除手术等，涉及一系列复杂炎症级联反应。肝脏血供中断后导致ATP缺乏，会引发炎症反应。恢复肝脏血流灌流可导致炎症信号通路的进一步大量激活，诱发大量肝脏细胞进一步凋亡、坏死，从而进一步加剧肝脏损伤。由于肝脏缺血导致的直接损伤和再灌注诱发的继发性损伤均涉及大量炎症信号通路的激活，因此抑制炎症是减轻肝脏缺血再灌注损伤的有效途径。

本实验结果显示，与IRI组相比，thymoquinone组肝脏失功、肝小叶破坏、肝细胞聚集坏死、肝血窦区充血肿胀、门管区炎性细胞浸润程度均明显减轻。这提示百里醌预处理可以明显减轻肝脏缺血再灌注损伤和肝脏病理改变。进而发现百里醌能下调促炎症细胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β的表达，提示百里醌可通过抑制炎症减轻肝脏缺血再灌注损伤。但百里醌抑制炎症的具体机制不明。最近研究发现JAK2/STAT3介导炎症在肝脏缺血中扮演重要角色[8-10]，而百里醌可调节JAK2/STAT3信号通路[11-12]。本实验结果显示，百里醌对JAK2和STAT3的表达无明显影响，但可抑制JAK2和STAT3的激活通过磷酸化修饰，与IRI组相比，thymoquinone组p-JAK2和p-STAT3的表达明显降低，这显示百里醌可通过抑制JAK2/STAT3信号途径的激活来减轻炎症，进而减轻肝脏缺血再灌注损伤。

综上所述，我们推测百里醌可通过抑制JAK2/STAT3信号通路介导的炎症反应来发挥保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。但除了抑制JAK2/STAT3信号通路外，是否还存在其它途径减轻肝缺血，尚需进一步研究。

[1] Patel RP, Lang JD, Smith AB，et al. Redox therapeutics in hepatic ischemia reperfusion injury [J]. World J Hepatol， 2014，6(1):1-8.

[2] Datta G, Fuller BJ, Davidson BR. Molecular mechanisms of liver ischemia reperfusion injury: insights from transgenic knockout models [J]. World J Gastroenterol， 2013，19(11):1683-1698.

[3] Darakhshan S, Pour AB, Colagar AH, et al. Thymoquinone and its therapeutic potentials [J]. Pharmacol Res，2015，Mar 27. pii: S1043-6618(15)00050-X.

[4] Ahmad A, Husain A, Mujeeb M,et al. A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb[J]. Asian Pac J Trop Biomed， 2013，3(5):337-352.

[5] Tao X, Sun X, Yin L,et al. Dioscin ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury through the downregulation of TLR4 signaling via HMGB-1 inhibition [J]. Free Radic Biol Med. 2015 Mar 12. pii: S0891-5849(15)00115-X.

[6] Liu A, Huang L, Fan H,et al. Baicalein pretreatment protects against liver ischemia/reperfusion injury via inhibition of NF-κB pathway in mice[J]. Int Immunopharmacol， 2015 ，24(1):72-79.

[7] Mcdonald KA, Huang H, Tohme S, et al. Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist eritoran tetrasodium attenuates liver ischemia and reperfusion injury through inhibition of high-mobility group box protein B1 (HMGB1) signaling[J]. Mol Med, 2015 ，20(1):639-648.

[8] Abd El-Ghany RM, Sharaf NM, Kassem LA, et al. Thymoquinone triggers anti-apoptotic signaling targeting death ligand and apoptotic regulators in a model of hepatic ischemia reperfusion injury[J]. Drug Discov Ther， 2009 ，3(6):296-306.

[9] Wang Y, Wong GT, Man K, et al. Pretreatment with intrathecal or intravenous morphine attenuates hepatic ischaemia-reperfusioninjury in normal and cirrhotic rat liver[J]. Br J Anaesth， 2012 ，109(4):529-539.

[10] Freitas MC, Uchida Y, Zhao D, et al. Blockade of Janus kinase-2 signaling ameliorates mouse liver damage due to ischemia andreperfusion[J]. Liver Transpl， 2010 ，16(5):600-610.

[11] Li F, Rajendran P, Sethi G . Thymoquinone inhibits proliferation, induces apoptosis and chemosensitizes human multiple myeloma cells through suppression of signal transducer and activator of transcription 3 activation pathway[J]. Br J Pharmacol， 2010，161(3):541-554.

[12] Kundu J, Choi BY, Jeong CH, et al. Thymoquinone induces apoptosis in human colon cancer HCT116 cells through inactivation of STAT3 by blocking JAK2-and Srcmediated phosphorylation of EGF receptor tyrosine kinase[J]. Oncol Rep， 2014，32(2):821-828.

武汉市科技攻关项目[2013062301010818]

R-332

A

1000-744X(2016)02-0156-04

2015-05-28)

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