以丙三醇为稳定剂的精浆检测质控品性能评价

张 琛， 李 婷， 孟庆昊， 谢 楠， 张为民， 赵 飞， 李 敏， 高 选， 杨斯桀

（山东大学附属生殖医院医学检验科，山东 济南 250001）

精浆生化分析是用于评估男性生殖能力的重要的检验项目，涵盖许多用于诊断男性不育和男性生殖系统疾病的生化标志物。精浆生化检测结果的准确性对于临床诊疗尤为重要。陆金春等[1]开展的精浆生化检测项目外部质控调研结果显示，男科学实验室开展的精浆果糖、α-葡萄糖苷酶检测结果差异很大，有必要标准化，男科实验室应建立有效的质控措施[2]。精浆生化指标的全自动检测均应带有相应项目的商品化或自制质控品[3]。目前的精浆生化质控品大部分为原厂适配试剂，无法检测试剂批次/盒间或患者样本偏移趋势，而精浆生化检测项目又缺乏第三方的质控品，故实验室自制精浆生化质控品是目前进行室内质控较好的选择。自制质控品与商品化质控品比较，其优势是不受运输条件影响，且为人源性样本，能够最大程度减少基质效应，更真实、准确地反映检测系统的稳定性。有研究发现，丙三醇是蛋白类项目质控品比较好的稳定剂[4]。本研究选用丙三醇作为稳定剂配制精浆生化质控品，并与未加入任何稳定剂的精浆原液进行对比，分别对2种质控品的均匀性、稳定性和实验室日常质控结果进行评价，以期获得稳定、低成本的质控品，规范精浆生化项目的检测。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2019年11—12月山东大学附属生殖医院进行精液检测的精液样本。要求受检者禁欲2～7 d，采用手淫法留取精液样本，收集1次射精的全部精液于清洁、无毒、密闭的取精管内（深圳博锐德公司），置于37 ℃水浴箱中完全液化。纳入标准：精液完全液化，pH值≥7.2，精子活动率≥50%，前向运动精子百分率≥40%；受检者乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病毒筛查结果为阴性，无生殖道或泌尿系统感染。本研究通过山东大学附属生殖医院医学伦理委员会审核。

1.2 方法

1.2.1 分离精浆 将符合要求的患者剩余精液样本3 000×g离心15 min，取上层精浆，混合后制备成质控品，使用漩涡振荡器将其充分混匀。

1.2.2 分组 根据实验目的将混合精浆分为2份，其中1份加入占精浆体积30%的丙三醇溶液（A组），另1份不加入任何稳定剂（B组）。

1.2.3 分装保存 将充分混匀后的精浆生化质控品一边用一次性吸管吹打使其一直保持混匀状态，一边用移液器分装于eppendorf管内，每管500 μL，每组各制作180管，置于-20 ℃冰箱冻存。

1.2.4 检测 采用Chemwell BRED 2900型全自动精浆生化免疫分析仪（美国Awareness公司）检测精浆果糖和精浆中性α-葡萄糖苷酶，试剂盒购自深圳博锐德公司。

1.3 精浆生化质控品的性能评价

根据CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[5]的要求对精浆生化质控品的均匀性和稳定性进行性能评价。（1）均匀性评价。随机抽取2种质控品各10管，于室温下放置15 min后融化混匀，连续检测每管质控品2次并记录数据，并进行单因素方差分析，根据F值查表判断质控品是否均一。（2）稳定性评价。分别于质控品配制后的第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85天随机抽取2种质控品各3支，置于液氮罐中保存。于第86天将定期抽取的质控品从液氮罐中取出，置于室温下放置15 min后融化混匀，每管质控品连续检测2次，并记录数据。检测方法：质控品配制后每7天从-20 ℃冰箱内取出6份样本置于液氮罐内保存，至第85天时从液氮罐内全部取出进行检测，每管质控品连续检测2次并记录数据，并进行t检验，根据t值查表判断质控品是否稳定。（3）2种精浆生化质控品每日常规检测。每天取出2种质控品各1支，随当日临床标本进行精浆果糖和精浆中性α-葡萄糖苷酶检测，并记录数据，连续检测30 d，根据30个数据点计算、s和变异系数（coefficient of variation，CV）。（4）A组精浆生化质控品的长期日常质控检测。根据前期实验结果，选定A组作为实验室长期使用的精浆生化质控品，连续检测6个月，并记录数据，根据所得数据点计算、s和CV。

1.4 统计学方法

1.4.1 均匀性 采用Excel软件统计均匀性检验数据，并进行单因素方差分析，分别计算2个组的F值。在每次抽取10个样本，每个样本测定2次的条件下，F临界值为F0.05（9，10）=3.02，若计算所得的F值＜3.02，表示质控品的均匀性较好。

1.4.2 稳定性 采用Excel软件统计稳定性检验数据，并进行t检验，分别计算2个组的t值。在稳定性评价测定6次（每次3管，每管测定2次）的条件下，t临界值为t0.05（5）=2.57，若计算所得的t值＜2.57，表示质控品的稳定性较好。

1.4.3 日常质控数据处理 采用SPSS 19.0软件比较2个组的CV。正态分布数据采用±s表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 均匀性检验结果

2种精浆生化质控品精浆果糖和精浆中性α-葡萄糖苷酶的F值均＜3.02，均匀性较好。见表1。

表1 2个组精浆生化质控品均匀性检测结果

2.2 稳定性检验

将2种精浆生化质控品第8、15、22、29、36、43、57、64、71、78、85天的质控数据分别与第1天的质控数据进行t检验，结果显示，A组第8、15、22、29天的精浆果糖质控数据所得t值均＜2.57（临界值），提示29 d内A组质控品的精浆果糖项目稳定；B组质控品的精浆果糖数据从第8天开始计算，所得t值＞2.57，提示B组质控品的精浆果糖项目在8 d内无法保持稳定。A组的精浆中性α-葡萄糖苷酶结果在实验期间所得t值均＜2.57，提示A组质控品的精浆中性α-葡萄糖苷酶项目在85 d内均稳定；B组质控品在第8、15、22、29天的精浆中性α-葡萄糖苷酶质控数据所得t值均＜2.57，提示29 d内B组质控品的精浆中性α-葡萄糖苷酶项目稳定。见表2。

表2 2个组2种精浆生化质控品稳定性评价结果（t值）

2.3 每日常规质控检测结果

对2种精浆生化质控品分别连续进行30 d的检测，得到20个质控数据，结果显示，2种精浆生化质控品检测结果均分布在±2s范围内，CV的变化均在10%以内。2个组CV差异无统计学意义（P＞0.05），即2个组质控品均可满足日常质控要求。2个组质控品精浆中性α-葡萄糖苷酶项目批间精密度（CV）均优于精浆果糖项目。见表3。

表3 精浆生化质控品常规检测结果比较

2.4 A组、B组质控品长期室内质控检测情况

A组质控品均一性、稳定性均较好，可用于日常质控检测。靶值和s的设定为日常检测前累计30 d的数据，使用A组质控品进行为期6个月的室内质控检测，共累计116个数据点；使用B组质控品进行为期4个月的室内质控检测，共累计97个数据点，其中A组2个项目CV的变化均＜15%，B组质控品2个项目的CV均高于A组，精密度与A组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 精浆生化质控品常规检测结果对比

3 讨论

随着辅助生殖技术的迅速发展，目前开展精浆生化项目检测的男科实验室数量急速增多，在为临床诊断提供更多选择的同时，随之而来的问题是精浆生化项目检测在质量控制上的短板。室内质控是保证实验室检测质量非常重要的一个环节，均匀、稳定的质控品非常重要。目前，国内商品化精浆质控品存在价格高、使用周期短的问题，男科实验室自制精浆质控品有较大的意义。

理想的临床化学检验质控品应具备有人源基质特征、无传染性、添加剂和调制物的数量尽可能少、瓶间变异小、稳定时间足够长等特点[6]。本研究自制精浆生化质控品均为人源精液，避免了基质效应，样本选择无传染性的样本，仅添加丙三醇作为调制物，均一性和稳定性均良好，满足自制质控品的全部要求。本研究在添加丙三醇的同时对质控品的浓度进行了调节，A组中加入质控品体积30%的丙三醇，故其检测值均低于B组的30%；通过调节精浆原液的取用量，可以获得不同浓度的质控品。本研究良好的均一性验证结果证实了精液选择与分装方法的有效性。精液液化不良会导致仪器检测时出现吸样不足或失败，从而产生随机误差。本研究在分装混合精浆时时刻保持混匀状态，采用边使用一次性吸管反复吹打边混匀边分装的方法，直至分装完毕，以保证各管质控品的均一性，结果显示，该方法配制的精浆生化质控品的均匀性好，稳定周期更长，可减少配制次数，以缩小质控品批间差带来的偏移。

精浆富含糖类、脂类和蛋白质，保持其中有活性的酶类的稳定是制备精浆生化质控品需关注的问题。本研究的稳定性验证结果显示，A组精浆果糖项目在29 d内于-20℃保存稳定性较好，精浆中性α-葡萄糖苷酶在85 d内于-20℃保存稳定性较好，A组质控品2个项目的稳定性均优于B组，与张志强等[4]将丙三醇用于酶蛋白类检测项目的质控品稳定性较好的结果一致。本研究分别对加入丙三醇配制的精浆质控品和未加入任何稳定剂的精浆原液质控品进行比较，以期能够评价更易普及的精浆生化质控品配制方法，为男科实验室室内质控的常规开展提供更优的选择。丙三醇通常用于室间质评样本保存，本研究结果显示，质控品内添加丙三醇作为稳定剂可使质控品稳定1个月左右，这对于室间质评样本检测和结果回报后的复测分析来说是足够的。开展精浆生化项目室间质评需考虑质控品在常温运输条件下的稳定性，后续将模拟常温下运输对于质控品稳定性的影响，以便于开展大范围的室间质评。

CV是重要的室内质控参数。本研究结果显示，精浆果糖项目的批间精密度较精浆中性α-葡萄糖苷酶大，原因可能是丙三醇的化学结构有利于维持中性α-葡萄糖苷酶的稳定，而对于糖类的稳定作用不明显，且果糖化学结构中的羟基易被氧化，较蛋白类的结构稳定性较差。本研究30 d常规质控数据显示，A组和B组精浆果糖项目的CV均＜10%，精浆中性α-葡萄糖苷酶的CV均＜5%，2个组CV的差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究A组质控品6个月监测数据显示，2个项目的CV均＜15%，满足英国男科学会提出的精液分析CV应＜20%的要求[7]，提示质控品的精密度较好。本研究中，日常质控数据中存在超出2s的数据点，可能为试剂或质控品存在瓶间差引起的偶然误差，后续进行质控检测时，应对试剂配制、质控品开瓶等操作信息进行记录，以便回顾异常质控数据，并分析原因，同时加强人员培训，推行标准化操作，减少误差。随着质控品使用时间的延长，本研究数据点离散度有所增大，这与质控品的稳定性随时间延长而下降有关，但仍然控制在可接受范围内，但究竟稳定期有多长，尚需要更长时间的室内质控监测。

综上所述，直接使用精浆原液作为日常质控也能够满足室内质控的要求，但需要频繁更换质控品配制批次，调整靶值，不利于室内质控的长期监测。使用丙三醇作为稳定剂制备质控品，并以丙三醇作为稀释液调节质控品所需的浓度水平，可满足室内质控要求。实验室应制定质控品制备的标准操作规程，保证较小的瓶间差异，从而满足男科实验室室内质控的需求。