质谱技术在临床微生物实验室中的应用前景

罗燕萍

(解放军总医院微生物科，北京 100853)

质谱技术在临床微生物实验室中的应用前景

罗燕萍

(解放军总医院微生物科，北京 100853)

摘要：目前应用于临床微生物实验室的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 是一种直接从完整细菌中获得蛋白指纹图谱，从而对细菌进行快速鉴定的方法，由于可以对常见细菌，诺卡菌、分枝杆菌、厌氧菌、酵母菌及丝状真菌进行快速和准确的鉴定，近年来备受推崇。该文对这次质谱专题刊登的1篇综述和4篇论著进行总结评价。相信随着相关研究的不断深入，这项技术在临床微生物实验室将有更广阔的应用空间。

关键词：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；细菌鉴定；临床微生物实验室

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0097-04R446.5

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.001

Abstract:The matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technique can be used to generate protein fingerprint signatures from whole bacterial cells. By comparing these fingerprints to a database of reference spectra by the various algorithms, bacteria can be rapidly identified. MALDI-TOF MS can be used for accurate and rapid identification of various microorganisms, such as common bacteria, Nocardia, Mycobacterium, anaerobe, yeast and filamentous fungi. MALDI-TOF MS have recently been widely introduced. The characteristics of one review and four papers published in the special subject about MALDI-TOF MS were reviewed. The development of studies in MALDI-TOF MS will play an important role in the application of mass spectrometry in clinical microbiological laboratories.

作者简介：罗燕萍，女，1960年生，硕士，主任技师，主要从事临床微生物耐药机制研究。

收稿日期：(2014-12-16)

The prospects of mass spectrometry application on microbiologyLUOYanping.(DepartmentofMicrobiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry； Bacteria identification；Clinical microbiology laboratory

自20世纪80年代起，质谱技术就已经成为科学研究中用于蛋白分析的强大工具。随着技术的不断成熟和广泛使用，其在微生物检验常规诊断中的作用越来越受到关注，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)已经进入临床微生物实验室用于病原菌鉴定，与传统的表型鉴定及分子生物学技术相比，MALDI-TOF MS快速、准确、成本低廉。本刊本期集中刊登“质谱技术在临床微生物检验中的应用”专题，旨在使临床和实验室工作者对其有一个全面的认识和了解。

一、MALDI-TOF MS目前的应用现状

传统的细菌鉴定流程通常是：根据细菌在不同培养基上的生长情况和菌落形态，应用一些简便、快速的试验如革兰染色、触酶、氧化酶等进行初步分类，然后通过手工生化试验或自动鉴定系统等来完成鉴定[1-2]。虽然有些试验几分钟即可完成，但大部分情况下，完成常规细菌鉴定至少需要8～18 h或更长的时间(如苛养菌)。分子生物学如聚合酶链反应(polymerase chain reactuin,PCR)、DNA 芯片、微阵列技术等方法虽然敏感性高，但费用高昂，且对操作人员、设备和环境有较严格的要求，不适合常规应用。MALDI-TOF MS是将完整的病原菌细胞(intact-cell，IC)直接进行检测，无需蛋白提纯，样本准备很简便，也有人称之为 IC MALDI-TOF MS。许多研究表明，IC MALDI-TOF MS敏感性很高，可以区分表型相似甚至相同的菌株，提供属、种、型水平的鉴定。目前报道使用质谱进行微生物鉴定方面的问题主要集中在质谱数据库容量和有些特定种属无法明确区分上。

二、质谱专题收录论文的主要内容

此次专题共刊登1篇综述和4篇论著。综述文章“MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用”，从MADLI-TOF MS的基本原理、在微生物鉴定中的应用、在科研中的应用等三方面比较全面地介绍了目前MALDI-TOF MS在临床微生物实验室应用的现状及前景。质谱技术对以葡萄球菌和链球菌为代表的革兰阳性球菌鉴定到种水平的准确率>99%，对肠杆菌科细菌鉴定到种水平的准确率为96.60%，非发酵菌为98.75%，结核分枝杆菌为94.90%，非结核分枝杆菌为94.60%，对以拟杆菌属为代表的厌氧菌可以达到97.50%，以酵母菌为主的真菌为97.30%。对临床常见分离菌鉴定到种水平的准确率很高，使质谱技术在临床微生物实验室中得到广泛应用。另外，从阳性血培养和尿液样本中直接鉴定病原菌作为一个研究方向也在大量的研究尝试之中，尚未完全应用于常规鉴定。利用特异峰值的分析对耐药基因、血清分型、毒力等的研究也在不断进行中。

本专题中“MALDI-TOF MS在中段尿样本细菌直接检测中的应用”一文，应用MALDI-TOF MS快速、直接检测中段尿样本中的细菌，尝试建立中段尿快速细菌检测和鉴定方法。其结论与国外相关研究相似：涂靶板之前必须将尿液样本进行离心处理；较高的细菌计数可以提高鉴定到种的正确率；如果是2种以上细菌混合感染，鉴定结果是否正确取决于2种细菌的比例。该方法可比常规尿培养鉴定方法提早40 h左右报告鉴定结果。

血流感染是一种严重的感染性疾病，当血培养瓶报告阳性时，微生物实验室只能给临床医师暂报涂片结果，较快明确病原菌是微生物实验室亟待解决的课题。目前国内、外很多学者尝试分子生物学方法如实时荧光定量PCR以及其它一些快速方法如微阵列技术、杂交探针、流式细胞术等直接从血培养阳性瓶中鉴定细菌。近几年还有一些研究使用MALDI-TOF MS直接从阳性瓶中鉴定细菌。该方法首先最重要的一步是将细菌从细胞组分中分离出来，FERRONI等[3]在样本中环节做了很大的改进，血培养瓶报阳性后，应用温和去污剂裂解细胞膜，这一步只需要几分钟，从而使整个鉴定过程缩短到不足30 min。本专题中“分离胶促凝管联合 MALDI-TOF MS直接检测血培养阳性细菌”一文，采用分离胶促凝管预处理方法，其优点是成本低廉，速度快(平均15 min/样本)，安全性好，没有过多的转移、洗涤等工序，不容易引起气溶胶等生物安全风险。缺点是纯度不佳，由于没有额外的洗涤步骤，最终得到的菌体富集物始终还是含有部分细胞碎片，其对革兰阳性菌和革兰阴性菌的检出率分别为80.10%和86.90%；联合法对念珠菌的检出率较低，仅为22.20%，还有进一步提升和改进的空间，期待通过方法学的改进使质谱技术直接实时鉴定血培养阳性瓶中细菌成为可能。

有学者将MALDI-TOF MS 与其它方法做比对进行细菌鉴定，得出的结论是质谱技术对常规分离细菌的鉴定正确率相对于其它方法而言较高。“MicroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统对肠杆菌科细菌鉴定能力的比较”一文，将关注点放在肠杆菌科细菌上，这2种仪器对细菌种的鉴定符合率分别为97.10%和83.30%，对于阴沟肠杆菌复合群内的阴沟肠杆菌、霍氏肠杆菌和路德维希肠杆菌，普通变性杆菌复合群中的普通变形杆菌和潘氏变形杆菌，液化沙雷菌群中的液化沙雷菌，小肠结肠耶尔森菌群中的小肠结肠耶尔森菌，质谱技术通常可以鉴定到种水平，而后者只能鉴定到群，印证了质谱技术对于常规分离细菌鉴定到种的正确率较高的结论。

“两种MALDI-TOF MS系统快速鉴定血培养中白念珠菌以外酵母样真菌”一文，比较了2种不同MALDI-TOF MS系统对白念珠菌以外酵母样真菌的鉴定率，目前市场上有不同厂家的质谱仪尽管原理相似，但各有自己的特点，该文的结论指出Autoflex MALDI-TOF MS 对念珠菌尤其是近平滑念珠菌复合体鉴定的分辨率较高，但本研究对比的菌株数略少(59株，包括11种真菌)，结论需要更大、更多样化样本的支持。如在LACROIX等[4]的两种质谱技术在念珠菌鉴定的研究中，样本量达到1 383株，最终2种方法的鉴定正确率均为98.30%，相差并不显著。

本次质谱专题收录的文章主要涉及到鉴定方法的比对和从血培养阳性及尿液样本中直接检测鉴定细菌，这也是近几年国内外相关研究的热点，我们也期待有更多质谱应用方面的研究，推动质谱技术在临床微生物领域的应用范围进一步扩大。

三、MALDI-TOF MS未来的发展方向

近年来，越来越多的临床微生物实验室开始引入MALDI-TOF MS进行常规样本的细菌和真菌鉴定，随着研究的不断深入，MALDI-TOF MS的应用领域也将变得越来越广泛，主要有3个方面：在流行病学中的应用、从患者样本中直接检测病原菌和对耐药机制的检测。

(一)流行病学

微生物实验室、感染控制人员和临床医师面临的挑战之一是在某个临床菌株暴发流行时可以得到菌株代表分类的特异数据，如沙门菌、链球菌等，为了准确得到血清型、亚型或其它分类，实验室必须耗费更多的时间做进一步检测，而且许多菌株分型需要特殊的试验方法、仪器、耗材等。因此，条件有限的实验室就需要外送做检测，可能导致检测时间延长、丢失重要的流行病学数据、增加检测费用、结果不准确等。但如果在微生物实验室内快速、准确完成重要数据的结果将会帮助临床医师、护士、感控人员和卫生机构处理、追踪感染病原菌并掌握其流行状况。目前，通过大量菌株的群、属、种分析，以及许多菌株分型研究的深入，MALDI-TOF MS所具备的鉴定这些高度相关菌株的能力将使临床微生物实验室的影响力提升。将来可能出现更加精密的MALDI-TOF MS仪器，不但可以鉴定病原菌，同时可以快速、准确地提供菌株的流行病学数据，这将使临床微生物实验室在医院感染控制、病原菌暴发、耐药菌国家监测及生物防御等领域扮演重要角色。

(二)MALDI-TOF MS直接从患者样本鉴定细菌

因为不需要对目标物质进行扩增以及其鉴定病原菌的高敏感性， MALDI-TOF MS直接从样本中检测细菌的能力可能取代PCR。通过对这些患者样本处理方法的改良，主要包括去除蛋白、核酸、细胞碎片等可以影响分析的组分，MALDI-TOF MS直接从样本中进行细菌鉴定的能力会进一步提高。以下是直接从不同样本类型中鉴定的报道。

1.尿液样本目前的研究表明，对于计数>105的尿液样本，通过低速离心去除细胞碎片和白细胞，高速离心得到细菌，再用甲酸和乙腈处理得到蛋白用于质谱分析，鉴定准确率>90%[5-6]。存在的问题是MALDI-TOF MS尚不能对混合感染的尿液进行准确鉴定；没有标准化的尿液前期处理流程。而上述的处理流程是目前被证实较简便、快速且保证质谱鉴定准确的方法[6-7]。总之，MALDI-TOF MS在单一细菌的尿液样本中直接检测具有很强大的、准确的鉴定能力。

2.脑脊液细菌性脑膜炎是临床最严重的感染之一，快速、准确的检测非常重要，目前通过MALDI-TOF MS直接检测脑脊液细菌的研究较少，有一份报道肺炎链球菌引起的脑膜炎，前期处理流程与尿液样本相似[8]。

3.血培养阳性瓶中直接鉴定目前有许多从阳性血培养瓶中准确鉴定病原菌的方法，但由于使用的软件不同，血培养瓶(培养系统)不同，因此，无法客观地比较这些方法的优劣。有的研究认为提取细胞蛋白优于完整细胞分析，无碳颗粒的血培养瓶会得到准确的鉴定率，而含有碳颗粒的血培养瓶则结果不好[9-12]。总之，从血培养瓶中直接检测细菌和真菌可以显著地缩短鉴定时间[13-14]，随着研究的深入，这些检测方法也会进一步改进，以获得更方便可行的操作和更高的敏感性，提高革兰阳性菌及念珠菌等病原菌的检出能力。

(三)耐药性检测

微生物实验室不但要提供精确的病原菌鉴定结果，同时还要检测其敏感性，为临床医生提供治疗依据。常规的药物敏感性试验方法比较费时，一些酶联免疫、凝集等方法只能局限于少数细菌。MALDI-TOF MS可为耐药基因检测提供一个很好的平台，可以分析几乎所有的耐药机制，目前报道的方法主要基于下列几种原理：分析抗菌药物及被修饰后的产物；分析细胞组分；分析核糖体DNA甲基化；检测突变等。

1.通过抗菌药物的变化检测酶活性如直接检测β-内酰胺酶活性，检测方法基本相似：收集新鲜培养的待测细菌，与β-内酰胺分子反应后，用MALDI-TOF MS检测β-内酰胺分子及其降解产物的特异峰[15-16]。有文献报道通过检测美罗培南及其降解产物，证实了30株产IPM-7、VIM-2的铜绿假单胞菌，产VIM-1、KPC-2、NDM-1的肠杆菌产生碳青霉烯酶，其敏感性和特异性均超过95%。检测β-内酰胺酶尤其是碳青霉烯酶的方法已经应用于一些常规实验室[17-21]。

2.MALDI-TOF MS直接检测耐药决定基团对多耐药细菌蛋白组学的研究可以建立耐药机制相关的主要蛋白指纹图谱，最近一种检测耐万古霉素肠球菌的方法已经被证实有效。这种方法可以在微生物实验室用于vanB阳性屎肠球菌的快速检测[22]。用MALDI-TOF MS区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌时有一定挑战，尽管有相关研究，但方法需要进一步优化和验证[23]。到目前为止，还没有一种方法可以检测其它的如β-内酰胺酶耐药决定基团的特异性峰值[24]。

3.分析细胞壁组分几乎一半以上的抗菌药物的作用靶位位于细胞壁上，因此，细菌细胞壁在抗菌药物耐药中的重要性不言而喻。其它抗菌药物则需要越过细胞壁屏障到达它们的作用靶点。对革兰阴性杆菌外膜蛋白的蛋白组学和基因组学研究表明，膜孔蛋白、外排泵、脂多糖等细胞组分系统主要是通过对不同抗菌药物泵入和泵出的调节而表现耐药的[25]。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及2D电泳结合MALDI-TOF MS指纹图谱可以用来鉴定耐药和敏感菌株表达水平不同的外膜及周浆蛋白，建立一个综合的数据库来研究各种细胞组分，在耐药检测中发挥不同的作用[26-27]。

4. 检测耐药机制MALDI-TOF MS通过分析DNA来检测耐药机制，如可以通过检测单核苷酸多态性来鉴定SHV-型、TEM-型超广谱β-内酰胺酶等[28-29]。

5.抗菌药物检测MALDI-TOF MS检测的相对分子质量范围较大，而抗菌药物的相对分子质量通常<1 000因此，基质和较高的背景干扰使得这项技术在检测抗菌药物时变得复杂。LIN等通过方法学的改进，目前已成功检测出水杨酰胺等6种抗菌药物，未来这种方法有可能用于耐药机制及检测血样本中的微生物毒素和药物等[30]。

随着质谱数据库及分析软件的不断更新，所有病原菌鉴定的时间都会缩短。尽管一些方法目前还不能常规应用于微生物实验室，但随着这些检测方法的不断优化和标准化，一定会有广阔的应用前景。实验技术不断发展，使得临床微生物实验室从曾经最慢速服务的实验室逐步转变为一个可以快速、准确为患者提供结果的充满活力的新实验室。我们相信MALDI-TOF MS在未来一定会在临床微生物实验室扮演更重要的角色。

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(本文编辑：姜敏)