MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用

戴颖欣，　李　敏

(上海交通大学医学院附属仁济医院检验科, 上海 200127)

MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用

戴颖欣，李敏

(上海交通大学医学院附属仁济医院检验科, 上海 200127)

摘要：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种软电离质谱，适用于分析蛋白质等生物大分子物质，可用来绘制微生物的蛋白质图谱，达到鉴定的目的。基于MALDI-TOF MS的蛋白质谱技术具有快速、准确、敏感性高、高通量等特点，目前已应用于细菌和真菌的鉴定，其在微生物耐药性分析、分型和毒力研究等科研领域的应用也初有成效，尚有巨大的发展空间。本文就以MALDI-TOF MS为代表的蛋白质谱技术在微生物检验和科研中的应用作一综述。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；微生物；检验；科研

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0102-06R446.5

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.002

Abstract:Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one kind of soft ionization mass spectrometry, which is suitable for the analysis of bio-macromolecule, such as protein. It can be used for microbial identification by mapping the microbial protein mass spectra. Since MALDI-TOF MS technology is well-known for its rapidity, accuracy, high sensitivity and high throughput, it has been applied in bacterium and fungus identifications. MALDI-TOF MS also has a good performance in the field of scientific research, including resistance analysis, bacterium typing and virulence study，and there is still a large space for development. In this paper, we reviewed the application of MALDI-TOF MS technology in microbial identification and scientific research.

基金项目：国家自然基金资助项目(81322025、81171623、81371875)；上海市卫生系统优秀青年人才计划(XYQ2011039)；上海市曙光人才计划项目(12SG03)

作者简介：戴颖欣，女，1992年生，硕士，主要从事病原微生物致病机制研究。

通讯作者：李敏，联系电话：021-68383297。

收稿日期：(2014-10-24)

Application of MALDI-TOF MS technology in clinical microbial determinationDAIYingxin,LIMin.(DepartmentofClinicalLaboratory,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; Microbiology; Determination; Scientific research

病原微生物引起的感染性疾病严重威胁着人类健康，近年来随着抗菌药物滥用导致多种细菌耐药以及部分新型细菌的出现使形势更加严峻。传统的微生物鉴定方法主要是基于表型的检测，包括革兰染色、微生物培养和生化试验等，因时间较长、鉴定范围窄，影响了病原微生物鉴定的速度和准确性，在一定程度上阻碍了感染性疾病的控制。因此，临床上急需快速而准确的病原微生物鉴定方法以改善感染性疾病患者疗效。近年来质谱技术发展迅猛，其中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)作为蛋白质组学研究的支柱技术，在推动微生物蛋白组学发展的同时，也为基于蛋白质指纹图谱的微生物鉴定奠定了基础。MALDI-TOF MS是一种新兴的软电离质谱，用于绘制微生物的蛋白质谱峰图谱，将临床微生物的质谱数据与已知微生物的标准蛋白指纹图谱数据库进行比较，达到鉴定的目的。由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等特点，MALDI-TOF MS已成为一项高效的微生物快速鉴定技术被用于欧洲的临床微生物实验室，并将逐步取代常规的检测方法。本文就以MALDI-TOF MS为代表的蛋白质谱技术在微生物检验和科研中的应用作一综述。

一、MADLI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要由三部分组成：(1)样本解析/电离室；(2)飞行时间质谱分析器；(3)粒子探测器[1]。MALDI-TOF MS的基本原理是将微生物样本与等量的基质溶液混合或分别点加在样品靶盘上，溶剂挥发后形成样本与基质的共结晶；利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样本吸附，基质与样本之间发生电荷转移使得样本分子电离；样本离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析，将检测到的离子峰为纵坐标，离子质荷比(m/z)为横坐标，形成质量图谱，通过软件分析比较，筛选并确定出特异性指纹图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。MALDI-TOF MS可用于分析多种类型的样本，包括有机分子溶液、核酸、蛋白质以及整个微生物，其中蛋白质和微生物是目前在临床微生物实验室应用最广的项目[2]。

二、MADLI-TOF MS在微生物鉴定中的应用

MADLI-TOF MS是一种软电离技术，特别适用于分析蛋白质、多肽等生物大分子物质。它可以直接分析完整的蛋白质分子而不需要进一步粉碎，正是这一特点使其在分析完整微生物的蛋白质谱方面具有很大的优势[1]。由于所得到的蛋白质图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定且进化保守的核糖体蛋白，因此，其鉴定结果稳定、可靠。用于微生物鉴定的样本既可以是分离培养的纯菌落，也可以是原始的临床样本[3]。样本可以浓缩、纯化或是进行一些预处理以提纯蛋白，也可以不经任何处理直接用于检测[1]。常规的临床微生物检测往往需要对大量不同的样本进行鉴定，这对MADLI-TOF MS的准确度和工作效率提出了挑战，目前已有许多研究对MADLI-TOF MS的临床应用价值进行了评估。

(一)MADLI-TOF MS对细菌的鉴定

SENG等[4]使用MADLI-TOF MS和常规方法鉴定来自临床的1 660个菌株，用16S rRNA测序补充鉴定不明确的菌株。结果显示 MADLI-TOF MS准确鉴定了95.4%的菌株，其中84.1%鉴定到种的水平，11.3%鉴定到属的水平，一开始未能鉴定的菌株在其蛋白质图谱数据得到补充后也鉴定正确。MADLI-TOF MS被VAN VEEN等[5]用于临床样本的高通量检测和前瞻性验证研究，他们首先用MADLI-TOF MS鉴定327个已知菌株，在菌属水平上得到95.1%的正确率，随后对980个临床菌株进行MADLI-TOF MS和常规生化系统的平行试验，结果两者在菌种水平上鉴定的正确率分别为92.2%和83.1%，证实了MADLI-TOF MS在鉴定菌种的准确性上优于常规生化系统。

除了对大量随机样本进行检测以外，部分研究还分别对不同种类的细菌进行了鉴定。其中，革兰阳性球菌主要以葡萄球菌和链球菌为代表。DUBOIS等[6]用MADLI-TOF MS对包含22种葡萄球菌的152个菌株进行了鉴定，其中99.3%(151/152)鉴定到种的水平。在近期一项研究中，Vitek MS v2.0 system (MALDI-TOF MS)从非肺炎链球菌种群中准确地区分出了肺炎链球菌，116株非肺炎链球菌中只有1株(<1%)被错判[7]。MALDI-TOF MS为这些具有挑战性的微生物鉴定提供了一种快速而简便的方法。临床上常见的革兰阴性杆菌主要包括肠杆菌和非发酵菌。HE等[8]使用基于MADLI-TOF MS的Biotyper system对从605份粪便样本中选出的304个可疑菌落进行了鉴定，其中包含22株沙门菌、39株志贺菌、3株肠出血性大肠埃希菌、2株小肠结肠耶尔森菌、2株弯曲菌和236株胃肠道正常菌群菌株。该系统正确鉴定出了沙门菌、小肠结肠耶尔森菌和弯曲菌，但是由于志贺菌、肠出血性大肠埃希菌和大肠埃希菌三者的特征性质谱高度相似，它们并未被准确鉴别。236株肠道正常菌群菌中，233株(98.7%)和228株(96.6%)分别鉴定到属和种的水平。值得一提的是，该研究的对象都是直接挑选自选择培养基上的可疑菌落，并未经过纯化，这将常规2~3 d的鉴定周期缩短到了孵育后的24 h内，由此表明Biotyper system可以作为筛选工具直接用于鉴定原始选择培养基上的菌落。除了肠杆菌科细菌外，非发酵菌由于其较低的生化反应活性和不同的形态，在使用常规表型方法检测时常常产生错误的鉴定结果。 DEGAND等[9]使用MADLI-TOF MS对非发酵菌进行了鉴定，先用包含多个菌种的一系列参考菌株的蛋白质谱作为基础建立非发酵菌的图谱数据库，再分别对临床的非发酵菌进行鉴定，得到了较高的准确率。此外，为了推动MADLI-TOF MS在临床微生物实验室的普及，MELLMANN等[10]还联合8个实验室对MADLI-TOF MS在非发酵菌鉴定方面的室间重复性进行了验证。8个实验室分别对60株秘密编码的非发酵菌进行检测，最终得到98.75%的室间重复性。

分枝杆菌的鉴定是临床微生物检测的重要部分，但是由于不同的菌种生长时间不同，加上其严苛的生长条件、较长的培养周期和较低的生长率，使分枝杆菌的鉴定成为临床微生物检测的一大难题。虽然分子探针和DNA杂交技术等相对快速而简便，但也因为只针对有限的几种分枝杆菌而使其应用受到限制。最近已有研究将MADLI-TOF MS运用于分枝杆菌的鉴定。NIITSUMA等[11]使用MADLI-TOF MS对临床分离的158株结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC)和37株非结核分枝杆菌(nontuberculousMycobacteria，NTM)进行了鉴定，鉴定结果显示MTC在种和属的水平上准确率分别达到94.9%和99.4%，NTM在属的水平上准确率达到了94.6%。周昭彦等[12]则对15株临床分离株和68株环境分离株NTM进行了鉴定，通过比较3种样本前处理和蛋白抽提方案建立了MADLI-TOF MS快速鉴定NTM的方法并进行了评价。

此外，MADLI-TOF MS还为一些特殊的、难鉴定的、甚至是新型的重组细菌提供了一条新的检测思路。如以脆弱拟杆菌为代表的厌氧菌，常涉及不同来源的混合感染，而脆弱拟杆菌群的分离株表型十分相似，加上生长速度远较需氧菌慢，常规和自动化的表型方法经常将其误判。NAGY 等[13]对277株拟杆菌属临床分离株进行鉴定，有270株(97.5%)被明确鉴定，其中23株的结果有别于表型鉴定方法，11株经测序后证实了MADLI-TOF MS的正确性。而XIAO等[14]则运用MADLI-TOF MS在重组细菌的鉴定中进行了大胆尝试，提出MADLI-TOF MS不仅可以作为鉴定重组细菌的一种快速、准确、高通量的方法，还为突变菌株甚至生物恐怖细菌的鉴定提供了新的可能。

(二)MADLI-TOF MS对真菌的鉴定

临床上由机会致病菌引起的侵袭性真菌感染逐渐增多，尤其是在免疫力低下的患者中，这是引起高发病率和病死率的重要原因。由于传统的生化方法不仅耗时而且需要相当的专业知识，因此临床上迫切需要快速、可靠的方法来鉴定真菌和辅助抗真菌药物的治疗。MARKLEIN等[15]对临床分离的267株真菌(包括250株念珠菌和其他的隐球菌、酵母菌、毛孢子菌等)分别用MADLI-TOF MS、常规表型及生化方法进行了鉴定。结果显示，MADLI-TOF MS准确鉴定了247株(92.5%),剩余的20株真菌在参考数据库得到补充后均被准确鉴定，整个实验没有假阳性存在。STEVENSON等[16]对MADLI-TOF MS用于临床重要酵母菌种的快速鉴定进行了评估，他们创建了参考酵母菌株的图谱数据库(包括8个属44种)，并对194个(含6属23种)临床菌株进行鉴定以测试数据库的准确性，其中192个(99.0%)菌株被MADLI-TOF MS准确鉴定。除了单一的评价MADLI-TOF MS在真菌鉴定中的作用，ZHANG等[17]使用基于MADLI-TOF MS的Vitek MS System和以核糖体DNA测序为选择性补充，作为侵袭性真菌监测的参考方法。该研究选取2011年中国医院侵袭性真菌监测网络上患有侵袭性真菌感染的患者作为样本来源，共收集到1 243株菌株(代表31种酵母菌)用于分析，Vitek MS v2.0 system的鉴定结果与内部转录间隔(internal transcribed spacer，ITS)区序列分析(酵母菌鉴定的金标准)进行比较。经Vitek MS v2.0 system鉴定，96.7%的菌株准确鉴定到种的水平，0.2%鉴定到属的水平，而2.4%和0.7%的菌株分别未能鉴定和被错判。经重复测试后，菌种水平上的准确率达到97.3%。在此基础上，结合Vitek MS system和核糖体DNA测序，99.7%的菌株得以准确鉴定，这为真菌感染监控的战略计划提供了切实可行的方法。

(三)MADLI-TOF MS对临床样本的直接鉴定

MADLI-TOF MS在微生物鉴定中的优势除了其本身具有的快速、准确等特点外，还体现在可检测样本的多样性，除了临床分离得到的菌株，还可以直接用于原始样本的检测，其中以阳性血培养和尿液样本为主要代表。

快速的病原菌检测对于血流感染的诊断和治疗有着极其重要的临床价值。血培养和鉴定是菌血症病原学诊断的金标准，而目前微生物实验室血培养和鉴定需要较长时间孵育，报告结果时间长，远不能满足临床对血流感染快速诊断的需要，MADLI-TOF MS有望解决这一问题。LA SCOLA 等[18]采用MADLI-TOF MS对阳性血培养瓶中的细菌直接进行鉴定，结果显示由自动化系统鉴定为阳性并且只含一种细菌的562个血培养样本中，370个(66%)被准确鉴定，未能鉴定的样本大多数都是草绿色链球菌。而在另外22个含有2种或2种以上菌种的阳性血培养样本中，只有1个菌种被鉴定正确。其它的研究也指出阳性血培养样本在直接鉴定中存在问题，一是草绿色链球菌与肺炎链球菌不易鉴别，还有混合菌血培养样本难以鉴定或容易错判[19]。此外，在MADLI-TOF MS直接鉴定阳性血培养样本的一些报道中有数据提示，MADLI-TOF MS的准确鉴定需要细菌浓度达到一定的标准(>107/mL)[20]。

尿培养是临床上诊断尿路感染的“金标准”，因为其可以同时兼顾病原体的鉴定和定量。但这种方法往往时间长并且成本较高，为了缩短时间和降低成本，FERREIRA等[3]将MADLI-TOF MS用于临床尿液样本的直接鉴定，样本处理只需要2次离心分别除去白细胞和收集细菌，简便易行。结果表明MADLI-TOF MS可以在短时间内高度准确地鉴定感染性尿液样本，并且针对有较高菌量计数(>105CFU/mL)的革兰阴性菌样本效果显著。

三、MADLI-TOF MS在科研中的应用

MADLI-TOF MS不仅在临床微生物鉴定中发挥着重要的作用，而且在微生物科研领域也有很大的应用前景。

(一)用MADLI-TOF MS进行细菌耐药性分析

MADLI-TOF MS可以用来快速检测抗菌药物的耐药性。近年来甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus，MSSA)的鉴别诊断对于临床治疗是一个很大的挑战。已有部分研究将MADLI-TOF MS用于鉴定MRSA，有实验发现MRSA和MSSA在500～3 500 m/z范围内的质谱存在差异[21-22]，并且质谱图谱准确地分为2个单独的组(即MRSA和MSSA)[22]。而随着头孢菌素类抗菌药物的广泛使用，我国肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)的比率居高不下，探索快速检测革兰阴性杆菌耐药性的方法十分重要。CAMARA等[23]使用MADLI-TOF MS鉴定野生型和氨苄西林耐药的大肠埃希菌，结果检测到氨苄西林耐药的大肠埃希菌约在29 000 m/z处有一个特异性峰值，最后证实该峰值对应β-内酰胺酶。近两年，MADLI-TOF MS也开始用于革兰阴性杆菌β-内酰胺酶尤其是碳青霉烯酶的检测[24]。除了细菌的耐药性相关检测，MARINACH等[25]将MADLI-TOF MS的应用拓展到一项新的方法用作白念珠菌的药物敏感性试验，该试验通过分析白念珠菌在不同浓度的氟康唑下蛋白图谱的变化来检测其对氟康唑的敏感性，结果显示蛋白图谱发生明显改变的最低药物浓度(minimal profile change concentration，MPCC)与美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的参考方法得到的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值高度一致。

(二)用MADLI-TOF MS进行分型和毒力研究

细菌种类繁多，且同种细菌常常有多种血清型，不同型别的细菌其生理生化特性可能存在明显差异，致病性等方面也可能完全不同。因此，对同一种细菌进行快速分型是临床微生物研究的一项重要课题。由于质谱图具有菌株特异性，MADLI-TOF MS可用于细菌的分型。WOLTERS 等[26]对MRSA菌株的质谱图进行分级聚类分析，发现MADLI-TOF MS分型结果与spa分型结果有很好的一致性。近期还有研究表明，MADLI-TOF MS可用于区分携带vanB基因的万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)与万古霉素敏感株，提示其在VRE分型中的潜在作用[27]。而MALDI-TOF MS对沙门菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌等多血清型细菌进行鉴定和分类也得到了初步应用,在沙门菌分型中表现出较好的分型能力。但是，由于目前MADLI-TOF MS在微生物分型方面尚未规范化和普及，因此还有很大的研发空间。与此同时，对于临床上所关注的细菌毒力问题，MADLI-TOF MS也有少部分涉及。杀白细胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)是金黄色葡萄球菌中一种典型的毒力因子 ，BITTAR等[28]在研究中发现带有PVL的金黄色葡萄球菌有特异性的4 448 m/z峰,而PVL阴性的金黄色葡萄球菌无此峰,用该方法可快速检测PVL阳性的金黄色葡萄球菌,检测的敏感性可达100.0%,特异性达90.6%。

(三)用MADLI-TOF MS分析潜在的生物标志物

除了在微生物耐药性分析、分型以及毒力等方面的应用外，MADLI-TOF MS还可用于分析细菌或疾病中存在的生物标志物。近期一项研究借助MADLI-TOF MS发现了MRSA和万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus，VISA)的1 774.1 m/z和1 792.1 m/z 2个峰，它们所对应的2种多肽存在于绝大部分社区获得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)中，而医院获得性MRSA(hosiptal-acquired MRSA，HA-MRSA)中则几乎没有，所以这2个多肽可作为区分CA-MRSA和HA-MRSA的生物标志物[29]。

四、总结和展望

以MADLI-TOF MS为代表的蛋白质谱技术具有快速、准确、灵敏、高通量等特点，加上其自动化和低消耗的优势而逐渐在临床微生物实验室被推广，并且有望在不久的将来取代传统的微生物鉴定方法。但是，现阶段MADLI-TOF MS在微生物鉴定中还存在一定的局限性，如微生物蛋白指纹图谱数据库不够完善，一些罕见菌种或新型细菌的图谱尚未被现有数据库收录，从而导致鉴定困难；含有混合菌种的血培养样本难以准确鉴别；同一菌属中相近的菌种容易错误鉴定；直接鉴定时，血培养和尿液样本中菌量对鉴定的影响；以及各临床实验室间由于培养习惯(培养基、培养时间、培养温度等)的差异对实验重复性的影响，这些问题都亟待解决。或许我们可以通过完善数据库、规范微生物的前处理、建立标准的检测流程提高准确性，还可以与部分常规方法相结合，最大程度上发挥蛋白质谱技术的作用。与此同时，MADLI-TOF MS已在微生物相关研究中崭露头角，它在今后的科研应用中还有很大的提升空间，有望在微生物耐药机制研究、细菌毒力因子研究、亚型分型等方面发挥更大的效用。随着蛋白质谱技术的不断发展，相信在不久的将来，它一定会成为微生物鉴定和科研领域的一大支柱。

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(本文编辑：姜敏)