MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统对肠杆菌科细菌鉴定能力的比较

刘 瑛，俞 静，陈 峰，刘婧娴，李媛睿，皇甫昱婵，沈立松

(上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092)

近年来，革兰阴性杆菌在临床微生物样本中的分离率已＞70%，超过革兰阳性菌，其中三分之二又为肠杆菌科细菌[1-2]。肠杆菌科细菌与人类关系密切，随着创伤性诊疗技术的广泛开展以及免疫抑制剂的广泛应用，由肠杆菌科细菌引起的医院感染逐年上升。因此，临床对肠杆菌科细菌的鉴定需求不断增加。临床微生物实验室快速、准确地鉴定此类细菌，对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)用于分析非挥发性生物大分子，已运用于微生物领域，尤其在菌株鉴定方面。本研究利用MicroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统(简称Vitek 2 Compact)同时对545株肠杆菌科细菌进行鉴定，若两者鉴定结果不一致，再用沙门菌血清凝集试验或细菌16S rDNA基因测序予以确认。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源 上海交通大学医学院附属新华医院临床微生物实验室以往参加卫生部和上海市临床检验中心质控菌株以及2013年3至12月从各类临床样本分离得到的肠杆菌科细菌，共545株。

2.仪器和试剂 Vitek 2 Compact及配套的革兰阴性杆菌鉴定卡(GN)购自法国BioMérieux公司，MicroflexTMMALDI-TOF MS仪和 α-氰基-4-羟基肉桂酸购自德国 Bruker Daltonics公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪购自德国Eppendorf公司，ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA测序仪购自美国Applied Biosystems公司，PCR扩增试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)公司，基因测序扩增试剂盒购自美国 Applied Biosystems公司，Bruker Bacterial Test Standard(BTS)、乙腈、三氟乙酸、乙醇和甲酸购自美国SIGMA公司，沙门菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司，麦康凯及SS平板购自上海伊华医学科技有限公司。

二、方法

1.Vitek 2 Compact鉴定 挑取平板上纯菌落，制备0.5麦氏单位浓度的菌悬液，用Vitek 2 Compact及其配套的GN鉴定板进行鉴定。

2.MALDI-TOF MS仪鉴定 (1)参数设置:线性操作模式，正离子，基质抑制偏转模式。脉冲离子提取时间:100 ns。相对分子质量:2000～20000;(2)制备样本:取待测样本(1个菌落)，加入 300 μL去离子水和900 μL乙醇，于Eppendorf离心管中充分混匀，离心后干燥沉淀，加入70%甲酸水溶液(1～80 μL)，充分混匀，加入等量的乙腈，充分混匀，20817×g离心2 min，取上清1 μL，滴加到 MALDI靶板上，室温晾干。1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸基质液覆盖上述样本点，室温晾干;(3)上机分析:靶板上机用flexcontrol软件作质谱分析，先用标准品(BTS)进行系统误差校正，再进行待测样本的质谱分析。使用MALDI Biotyper 3.0数据库进行数据比对，评分≥1.7表示样本图谱与数据库中的相应菌株图谱高度相似，结果高度可信。本研究均选取评分≥1.7的结果作为待测样本的鉴定结果。

3.血清凝集试验 沙门菌的血清凝集试验具体操作方法见《全国临床检验操作规程》(第3版)[3]。

4.基因测序 采用水煮法提取细菌基因组DNA，以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，使用细菌16S核糖体通用引物序列16S rDNA(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')[4]，PCR 体系配置按试剂盒说明书进行，PCR程序为:94℃3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 个循环;72℃ 5 min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，割取含1500 bp左右清晰DNA条带的琼脂凝胶块，用DNA胶回收试剂盒回收其中的PCR产物作为测序单向PCR反应的模板，单向PCR反应的具体体系与扩增程序参考BigDye Terminator v3.1测序试剂盒操作手册。单向PCR反应产物经过回收后使用310测序仪进行测序得到DNA序列，通过NCBI网站BLAST工具进行DNA序列比对分析，得到菌株所属分类。

结 果

一、3种肠杆菌科细菌的质谱鉴定图谱

大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌等3种临床最常见的肠杆菌科细菌的质谱鉴定图谱见图1。3种肠杆菌科细菌有相同的特征峰，如4365、5381和7158 amu，大肠埃希菌和阴沟肠杆菌相同的特征峰为6254 amu，也有各自特异的特征峰，大肠埃希菌特异的特征峰2689和5096 amu等，肺炎克雷伯菌特异的特征峰3146、4740、6290、7706 和 9482 amu 等，阴沟肠杆菌特异的特征峰3128、5122、7690、8331 和9511 amu等。

图1 3种常见肠杆菌科细菌的质谱图

二、MicroflexTM MALDI-TOF MS的鉴定结果

545株细菌中鉴定到种、属的分别为529株(97.1%)和16株(2.9%)。除了 6株肠杆菌属细菌和10株沙门菌属细菌被鉴定到属外，其余菌株均被鉴定到种。见表1。

三、Vitek 2 Compact鉴定结果

545株细菌鉴定到种、群、属的分别有454株(83.3%)、76 株(13.9%)、12 株(2.2%)，另有 1株(0.2%)鉴定错误，2株(0.4%)未鉴定出。其中鉴定到群的细菌有肠杆菌属(54株)、沙门菌属(10株)、变形杆菌属(8株)、沙雷菌属(3株)和耶尔菌属(1株)。鉴定到属的细菌有肠杆菌属(1株)、枸橼酸杆菌属(1株)、拉乌尔菌属(6株)和泛菌属(4株)。鉴定错误的是1株非脱羧莱克勒菌，未能鉴定出的是2株大肠埃希菌。见表1。

四、MicroflexTM MALDI-TOF MS和 Vitek 2 Compact鉴定比对

545株肠杆菌科细菌中有83.3%(454/545)在2个系统中鉴定结果一致且均鉴定到种水平。鉴定结果不一致的91株细菌中，75株细菌被MicroflexTMMALDI-TOF MS系统正确鉴定到种水平，而Vitek 2 Compact则仅能将其中76株细菌鉴定到群水平。见表2。

表1 MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact对肠杆菌科细菌鉴定结果比较

续表1

表2 MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact鉴定结果对比 [株(%)]

讨 论

肠杆菌科细菌是一类分布广泛且常见的医院感染病原菌，可引起泌尿道及伤口感染、血流感染、肺炎、脑膜炎等，受到临床日益关注。目前，在医院临床微生物实验室中，肠杆菌科细菌的传统鉴定方法主要有手工板条法和仪器法，仪器法中以Vitek 2 Compact最为常见，它们都是依据细菌生化反应结果进行鉴定，时间长且成本高。MALDI-TOF MS技术作为一种新型的微生物鉴定方法，依据特征性蛋白图谱进行分类和鉴定，已在微生物领域尤其细菌鉴定中得到广泛运用[5-11]。

本研究采用 MicroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact同时对545株肠杆菌科细菌进行鉴定，结果不符的菌株用沙门菌血清凝集试验或细菌16S rDNA基因测序予以确认。这2种仪器对细菌种的鉴定符合率分别为97.1%和83.3%。在Vitek 2 Compact数据库中，由于阴沟肠杆菌、霍氏肠杆菌和路德维希肠杆菌包括在阴沟肠杆菌复合群，普通变形杆菌和潘氏变形杆菌同属一个复合群，液化沙雷菌和小肠结肠耶尔森菌分别归于液化沙雷菌群和小肠结肠耶尔森菌群，导致这些细菌只能鉴定到群;同样由于数据库原因，分散泛菌只能被鉴定到属。而MicroflexTMMALDI-TOF MS仪数据库中包含的肠杆菌科细菌参考图谱种类比Vitek 2 Compact细菌数据库多，因此，前者对这些细菌都能正确鉴定到种。在14株沙门菌株中，MicroflexTMMALDI-TOF MS对猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌能直接鉴定到种，Vitek 2 Compact则对甲型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌和肠炎沙门菌亚利桑那亚种直接鉴定到种，其余菌株都只能鉴定到属或群，需用沙门菌血清凝集试验进一步确认。有2株大肠埃希菌在Vitek 2 Compact上未能鉴定出，分析其原因可能由于其菌落特别黏稠，不易制备成均匀的菌悬液，致使其不能准确鉴定。由于MicroflexTMMALDITOF MS数据库中志贺菌属的数据缺乏，因此，本研究不包括志贺菌属的鉴定结果。

本研究结果显示，MicroflexTMMALDI-TOF MS对于肠杆菌科细菌的鉴定符合率高于Vitek 2 Compact。随着方法改进和数据库完善，MicroflexTMMALDI-TOF MS对细菌的鉴定符合率将进一步得到提高，而且其操作简便、快速，成本低，可以满足临床微生物实验室对肠杆菌科细菌的快速鉴定需求，为临床进行有效、及时的抗感染治疗提供帮助。

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