慢性肾小球肾炎患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的变化及其临床意义

周韵娇，　李　鹏，　张丽红，　钱英俊，　牛建英

(1.复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室，上海 200240；

2.复旦大学附属上海市第五人民医院肾内科，上海 200240)

慢性肾小球肾炎患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的变化及其临床意义

周韵娇1，李鹏2，张丽红2，钱英俊2，牛建英2

(1.复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室，上海 200240；

2.复旦大学附属上海市第五人民医院肾内科，上海 200240)

摘要：目的探讨慢性肾小球肾炎(CGN)患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞百分率的变化在疾病进程中可能的细胞免疫学机制。方法采用流式细胞术检测50例CGN患者及30名正常人(对照组)外周血Th1/Th2和CD28+细胞的百分率，用SPSS 16.0软件对试验结果进行统计分析。结果与对照组比较，CGN患者外周血CD3+CD4+细胞百分率和CD4/CD8比值明显降低(P<0.05)，Th1和Th2细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)，但Th1/Th2比值明显增高(P<0.05)；CGN患者CD28+、CD4+CD28+细胞百分率明显减少(P均<0.01)。结论CGN患者体内T细胞免疫功能紊乱和活化受限，细胞免疫功能低下，Th1和Th2细胞失衡，通过对CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的检测，有助于了解患者的细胞免疫状态，为临床诊断和免疫治疗提供参考依据。

关键词：Th1/Th2细胞；CD28+细胞；流式细胞术；慢性肾小球肾炎

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0141-04R446.63

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.009

Abstract:ObjectiveTo investigate the possible mechanism of cellular immunology in the process of chronic glomerulonephritis (CGN) by the detection of Th1/Th2 ratio and CD28+cell percentages from peripheral blood in patients with CGN. MethodsTh1/Th2 ratio and CD28+cell percentages were detected by flow cytometry from 50 patients with CGN and 30 healthy subjects (control group). SPSS 16.0 software was used to analyze the results. ResultsCompared with control group, the percentages of CD3+CD4+cells and CD4/CD8 ratio of patients with CGN decreased significantly (P<0.05). Although there was no statistical significance in the percentages of Th1 and Th2 cells (P>0.05), yet Th1/Th2 ratio increased significantly (P<0.05). The percentages of CD28+and CD4+CD28+cells decreased significantly (P<0.01). ConclusionsT cell immune function is disorder, and activation is restricted in patients with CGN. Their cellular immune function is low, and there exists imbalance between Th1 and Th2 cells. The detection of Th1/Th2 ratio and percentages of CD28+cells from peripheral blood in patients with CGN is valuable to understand the immune state so as to provide the theoretical basis for immune therapy.

基金项目：闵行区科委自然基金项目(2010MHZ027)

作者简介：周韵娇，女，1981年生，硕士，主管技师，主要从事细胞免疫研究工作。

通讯作者：牛建英，联系电话：021-64308151。

收稿日期：(2014-02-25)

The variation and its clinical significance of Th1/Th2 and CD28+cells from peripheral blood in patients with chronic glomerulonephritisZHOUYunjiao1,LIPeng2,ZHANGLihong2,QIANYingjun2,NIUJianying2.(1.CentralLaboratory,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China; 2.DepartmentofNephrology,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China)

Key words: Th1/Th2 cell; CD28+cell; Flow cytometry; Chronic glomerulonephritis

慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是引起肾功能衰竭的主要病因，其发病机制复杂，不仅与体液免疫有关，而且免疫活性细胞也参与了疾病的发生和发展。作为免疫炎症性肾病，体液免疫在CGN发病及进展中的机制已经得到了广泛而深入的研究和证实，而关于CGN细胞免疫方面的研究较少。T淋巴细胞是机体细胞免疫的重要指标，在CGN的发生与发展中起着重要的作用，而T细胞的活化是其发挥免疫效应的基础。本研究通过观察50例CGN患者外周血Th1/Th2细胞比值及共刺激分子CD28的水平，探讨Th1/Th2细胞比值及共刺激分子CD28的变化在CGN进展过程中可能的细胞免疫学机制，为临床诊断和寻找有效、合理的治疗手段提供线索和思路。

材料和方法

一、研究对象

收集上海市第五人民医院CGN患者50例，其中男30例，女20例，年龄(55.06±15.71)岁，诊断符合“1992年《中华内科杂志》编委会肾病专业组“原发性肾小球疾病分型与治疗及诊断标准”[1]，排除继发性肾小球疾病、合并感染及其它自身免疫性疾病，所有病例半年内未使用糖皮质激素和免疫抑制剂等治疗。对照组为上海市第五人民医院同期体检健康者，共30名，其中男18名，女12名，年龄(52.67±13.42)岁，无自身免疫性疾病或遗传性疾病家族史。

二、 试剂和仪器

1.试剂双色淋巴细胞亚群分析试剂盒[抗体组成为CD3/CD4、CD3/CD8、IgG1/IgG2a，均为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/藻红蛋白(phycoerythrin, PE)双色标记]、CD3-多甲藻叶绿素蛋白(multivalent algal chlorophll protein, PerCP)、CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE、白细胞介素4(interleukin4, IL-4)-PE、干扰素γ(interferon gamma,IFN-γ)-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG2b-PE均为Becton-Dickinson(美国)公司产品，溶血素、固定破膜剂和标准荧光微球为Beckman Coulter公司生产，佛波醇酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、莫能霉素(monensin)、离子霉素(ionomycin)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)均为Sigma公司(美国)产品，RPMI1640、胎牛血清、青链霉素均为GIBCO公司(美国)产品，无水甲醇为国药集团(中国)生产。

2.仪器Beckman Coulter Epics XL流式细胞分析仪(美国)，Thermo Forma公司(美国)CO2培养箱，Eppendorf 5702低速离心机(德国)。

三、 方法

1.样本采集 所有研究对象于清晨空腹静脉采血2 mL(肝素抗凝),充分颠倒混匀，用于流式细胞术分析。

2.T细胞亚群及CD28+细胞的检测采用流式细胞术检测所有研究对象外周血中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+细胞百分率。

四、 统计学方法

结果

一、CGN组和对照组外周血T淋巴细胞亚群

与对照组比较，CGN患者CD3+CD4+细胞百分率和CD4/CD8比值降低(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+细胞百分率差异均无统计学意义(P>0.05)；Th1/Th2比值增高(P<0.05)，但Th1和Th2细胞百分率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1CGN患者与对照组外周血T细胞亚群结果比较

组别 CD3+(%)CD3+CD4+(%)CD3+CD8+(%)Th1(%)Th2(%)CD4/CD8Th1/Th2对照组65.69±6.3837.43±5.0723.50±7.249.90±3.121.45±0.591.85±1.007.62±2.91CGN组63.46±7.3734.65±5.53*27.28±8.8111.51±3.931.30±0.371.47±0.72*9.67±5.15*

注：与对照组比较，*P<0.05;CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞百分率用占淋巴细胞总数的百分比表示，Th细胞百分率用占CD3+细胞的百分比表示

二、CGN组和对照组外周血CD28+细胞

与对照组比较，CGN患者CD28+和CD4+CD28+细胞百分率明显降低(P均<0.01)，CD8+CD28+细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2CGN患者与对照组外周血CD28+细胞

百分率结果比较

组别 CD28+CD4+CD28+CD8+CD28+对照组56.69±6.8234.04±4.878.35±3.47CGN组50.54±5.59*30.58±5.30*9.50±2.53

注：与对照组比较，*P<0.01；CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+细胞用占CD3+细胞的百分比表示

讨论

CGN是一种病程迁延、缓慢、进行性发展的慢性肾病，以往对CGN免疫病理机制的研究较集中于细胞因子网络，由其介导的免疫反应在疾病进展中的机制也已经得到了公认[2-3]，而对免疫活性细胞在疾病进展中的机制研究较少，但它却在CGN的整个病程中发挥着重要的作用[4-5]。

淋巴细胞是人体内最主要的免疫活性细胞，正常情况下，机体通过淋巴细胞亚群间的相互作用维持正常的免疫功能，某一亚群数量或功能的异常，均会导致机体的免疫紊乱，出现一系列的病理改变。T细胞是淋巴细胞中的主要细胞亚群，是细胞免疫和免疫调节的主要执行者，其数量和活性的改变是机体细胞免疫状态的重要指标。CD4+和CD8+细胞是T淋巴细胞的2个亚群，两者形成的T细胞网络维持并调节体内免疫功能的平衡，任何原因引起的CD4+或CD8+细胞数量的升高或降低都会使两者比例失调，导致机体免疫功能的异常或紊乱，从而出现自身免疫性疾病。

CGN作为一种感染引发的自身免疫性疾病，细胞免疫在疾病的发生、发展过程中发挥着重要的作用，肾纤维化患者出现大量的CD4+T淋巴细胞浸润[6]。为了深入探讨细胞免疫介导的CGN的可能发病机制，本研究采用流式细胞术检测了50例CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+细胞的百分率。为了获得更准确和可靠的试验结果，检测前，采用标准荧光微球对仪器进行光路校准。试验结果显示，与对照组相比，CGN患者CD3+CD4+细胞百分率和CD4/CD8比值明显降低，CD3+CD8+细胞百分率虽有增多趋势，但差异无统计学意义。CD3+CD4+细胞百分率的降低导致CD4/CD8比值的变化，说明CGN患者存在T细胞亚群失衡，机体细胞免疫功能紊乱，CD3+CD4+细胞是引起T细胞亚群失衡的主要因素，该结果证实了已有的报道[4]。

CD4+T细胞根据产生的细胞因子和功能不同可以分为Th1和Th2亚群，Th1具有促进细胞免疫和免疫调节的作用，其效应反应失调会导致细胞免疫介导的器官特异性自身免疫性疾病，Th2具有增强体液免疫和免疫调节的作用，2种细胞比例的失调与自身免疫性疾病的发病密切相关。本研究以CD4+IFN-γ+和CD4+IL-4+分别作为Th1和Th2细胞的标志，结果显示，CGN 患者Th1和Th2细胞百分率较对照组分别有增多和减少的趋势，但差异无统计学意义，而Th1/Th2比值较对照组增高。该结果说明CGN患者存在Th1/Th2平衡失调，机体内环境的稳定性遭到破坏，这可能与CGN患者细胞免疫功能的异常和细胞介导的免疫病理过程有关。

细胞免疫应答的中心环节是T细胞对抗原的识别和有效激活，这是一个由多因素参与的复杂的生物学过程，有赖于共刺激分子提供协同刺激信号，从而调节机体免疫功能。在这一过程中，CD28和B7分子分别作为受体和配体，在T细胞的活化和增殖中起主导作用[7]。CD28分子持续表达于T淋巴细胞表面[8]，与表达在抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)上的B7分子结合，为识别APC提呈的特异性抗原后的初始T细胞提供协调刺激信号，促进T细胞活化和增殖，增强免疫应答[9]。此外，CD28/B7还参与调节Th细胞的分化，CD28分子与B7的相互作用，促进Th2细胞分化，间接抑制Th1的分化[10-11]。有研究表明，CD28+细胞参与了终末期肾脏病患者的疾病进程，接受腹膜透析的患者，CD4+CD28null细胞较健康对照组明显增多[12-13]。

本研究结果显示，CGN患者CD28+、CD4+CD28+细胞百分率较对照组明显减少，CD8+CD28+细胞百分率差异无统计学意义。CD28分子作为T细胞活化和耐受的关键调节分子，在Th(CD4+)细胞上的表达低下，说明CGN患者Th细胞的活化受到限制，从而不能产生有效的细胞免疫应答，导致CGN患者细胞免疫功能低下，体液免疫也因此受累。由于CGN患者CD28+细胞百分率的降低，无法产生足够的信号促进Th2细胞的分化，间接促进了Th1细胞的分化。Th1细胞通过分泌相应的细胞因子启动并促进了肾组织的炎症，从而加重肾脏的损伤。

综上所述，CGN患者存在细胞免疫功能紊乱和T细胞亚群失衡，CD3+CD4+细胞是引起该失衡的主要因素，Th1/Th2平衡失调可能与细胞介导的免疫病理过程有关；CGN患者T细胞活化受抑，导致细胞免疫功能低下。通过对CGN患者外周血Th1/Th2和CD28+细胞的检测，有助于了解体内细胞免疫状态，对病情的判断和预后有一定的临床参考价值，为免疫治疗提供理论依据。

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(本文编辑：姜敏)