2014版ICSH血液分析仪评价指南介绍(下)

胡晓波，　宋　颖，　王　青，　金大鸣，　熊立凡

(1.上海交通大学医学院附属第三人民医院，上海 201900；2.上海市临床检验中心，上海 200126；

3.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200001)

2014版ICSH血液分析仪评价指南介绍(下)

胡晓波1，宋颖2，王青2，金大鸣2，熊立凡3

(1.上海交通大学医学院附属第三人民医院，上海 201900；2.上海市临床检验中心，上海 200126；

3.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200001)

摘要：介绍了2014年国际血液学标准化委员会(ICSH)关于血液分析仪的性能评价指南。该指南从仪器的进样模式、批内精密度、批间精密度、携带污染、线性、标本稳定性、参考区间、准确性和可比性等方面对厂商提出了具体确认、评价的方法和要求，并推荐对流式细胞术和/或数字成像技术的白细胞分类计数、有核红细胞计数和未成熟粒细胞计数采用流式细胞免疫表型参考方法进行评价。每个临床实验室在仪器用于患者标本检测前，应对上述性能进行部分确认或转移。

关键词：血液分析仪；评价；确认；验证；数字成像；流式细胞

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0001-06R446.1

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.001

Abstract:Introduces the International Council for Standardization in Haematology (ICSH) guideline for the evaluation of blood cell analyzers, 2014 edition. In this guideline, the performance evaluation, including sampling mode, within-run precision, between-run precision, carry-over, linearity, sample stability, reference interval, accuracy and comparability of haematology analyzers, should be conducted through validation and verification by manufacturers. The assessment of flow cytometry-based or digital imaging-based leukocyte differential count, nucleated red blood cell count and immature granulocyte count is recommended by flow cytometry immune-phenotypic counting as a reference method. A part of validation or transference of instrument should be performed by each clinical laboratory before reporting patient results.

作者简介：胡晓波，男，1969年生，硕士，主任技师，主要从事临床检验基础研究。

收稿日期：(2014-11-24)

Introduction of the ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analyzers, 2014 edition (Ⅱ)HUXiaobo1,SONGYing2,WANGQing2,JINDaming2,XIONGLifan3.(1.TheThirdPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China; 2.ShanghaiCentreforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China; 3.RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200001,China)

Key words: Haematology analyzer; Evaluation; Validation; Verification; Digital imaging; Flow cytometry

7.准确度准确度是检测结果与已知真值之间的一致程度。真值概念不适用于全血细胞计数(complete blood count, CBC)的许多参数。真值由决定性参考方法获得，而参考方法常不适用于CBC。CBC中能正确估计的相关参数是血红蛋白、血细胞压积(packed cell volume, PCV)、红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、网织红细胞(reticulocyte, Ret)计数和白细胞分类计数。氰化高铁血红蛋白法是国际推荐的血红蛋白浓度测定的参考方法。其原理是用含氰化钾和高铁氰化钾的溶液稀释血液，除硫化血红蛋白外，血红蛋白和碳氧血红蛋白(HbCO)均转化为氰化高铁血红蛋白，用分光光度计在540 nm处比色，或使用带黄绿色滤光片的光电比色仪比色，测定溶液吸光度。目前，大多数计数仪采用手工法改良氰化试剂或无害的化学试剂(如十二烷基硫酸钠)检测血红蛋白，可避免因处理大量含氰废弃物而造成的环境污染。无论采用哪种方法检测血红蛋白，氰化高铁血红蛋白法是唯一可接受的参考方法。测定Ret推荐采用流式细胞术作为参考方法，检测精密度高于使用新亚甲蓝染色的手工方法。手工方法虽然主观且不精密，但目前仍是可接受的参考方法。美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) H26-A2文件指出：手工Ret计数的参考方法是流式细胞术，但在常规临床实验室中通常不使用。在实践中，除白细胞分类计数项目推荐与参考方法(即手工分类400个白细胞)的结果进行比较外，许多临床实验室还常比较待评价仪器与常规仪器之间的结果，但对国家级评价而言，如检测系统之间的结果有明显差异时，应采用上文列出的参考方法进行评价。

8.可比性在比较待评价仪器与目前常规仪器的测定结果时，应尽可能使用大量正常和异常标本，包括含干扰物质的标本，其中正常标本应占总数的1/2～1/3。完整验证需要的总标本量至少为250～300份，表1(见本刊2014年第29卷第12期第1204页)列出了应包括的各种标本。标本应至少能在1周或更长时间内检测，以评估仪器变异和实验室内患者群体的每日变异。检测结果应作图，以显示待评价仪器(Y轴)与常规仪器(X轴)之间结果的差异。采用回归分析、相关分析和特定的Bland-Altman散点图进行一致性评估。相关系数是一种估计落在直线上的数据是否良好的量值，其越接近1.0越显示线性。斜率、截距、相关或偏移是很重要的评估信息。因仪器不能正确识别所有细胞(如白血病原始细胞等)，所以在进行方法学比较时，应了解离群值的医学诊断价值。因为在分析所有数据时易忽视低值的差异，所以对白细胞减少、贫血和血小板减少的标本应注意观察平均差异或Bland-Altman散点图。应计算所有分析误差(即基于仪器之间的差异)，即使两台仪器的结果存在偏移，线性回归分析也可能显示为有良好的相关性，所以当结果呈正态分布时，相同标本的配对数据应采用配对t检验；而对于非正态分布的数据，配对数据可采用Wilcoxon秩和检验或Mann-WhitneyU检验。一般情况下，所有上述试验以P<0.05为差异有统计学意义。应解释任何标本出现极端值的原因，极端值不能和其他结果合并，否则会影响统计分析结果。当待评价仪器测定结果与常规仪器的结果存在离群值时，应采用上述参考方法检测标本。所有标本应制备血涂片，并做显微镜检查。某些参数仅在一种或型号有限的仪器上使用，如低色素红细胞百分比、网织红细胞血红蛋白量/浓度或未成熟血小板分数。此时，这些参数或许不可能与另一种方法进行结果比较，但对这些参数的结果也应进行评估，以确定是否与患者诊断和临床情况一致且适当。当血液分析仪采用单克隆抗体和流式细胞术检测某些细胞时，如抗CD61标记血小板。抗CD4和抗CD8标记淋巴细胞亚群应按CD4+T细胞群分析指南与已验证的流式细胞仪的检测结果进行比较，或与当前临床实验室测定CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的流式细胞术进行比较。

9.白细胞分类参考方法[含有核红细胞(nucleated red blood cells, NRBC)和未成熟粒细胞(immature granulocytes, IG)]推荐采用2×200个白细胞分类的参考方法，含NRBC和IG计数。一般由两位有经验的检验人员对所有标本进行检查，若两位检验人员的结果不一致，由第3位检验人员复查。不同的自动计数仪对异常细胞的处理方法不同，如某些仪器原先只能提供异常细胞报警提示，现已能计数NRBC和IG。如果仪器报警提示原始细胞，应与形态学检查结果相关。相似方法可用于某些仪器提供的红细胞碎片报警或研究计数类的参数。对血液分析仪全面评价机构或制造商来说，今后将推荐采用流式细胞术做白细胞分类。使用数字成像系统分析白细胞可能会替代显微镜方法，但在引入评价或临床实验室前应对其进行评估/验证。此类评估/验证应含正常和异常标本(包括各系异常形态)，并采用手工分类2×200个白细胞或流式细胞术的方法。

10.数字成像血液系统数字成像系统已有很长的历史，始于20世纪60年代后期和70年代早期。数字成像系统可对楔形涂片做WBC五分类和形态学检查。随着常规三分类血液分析仪以及之后五分类自动分类技术的广泛应用，这些数字成像系统的持续维护成本及系统性能的局限性(取决于楔形涂片、涂片上细胞分布、染色一致性)导致了这些原始仪器系统的消亡。随着计算机系统、复杂处理能力和图形分析软件的改进以及人工神经网络的出现，数字成像系统重回临床实验室，用于血常规分析。该系统有两种类型：(1)具备预分类功能的细胞定位系统(即数字细胞定位/预分类系统，由有经验的检验人员确认细胞)：目前，美国FDA批准了两种数字细胞定位/预分类系统，即“由有经验的检验人员确认的具备预分类功能的细胞定位仪”，由检验人员决定所有细胞(正常和异常)的最终分类。除美国以外还有其他国家有其它系统可用。数字细胞定位/预分类系统对细胞的准确识别取决于血涂片的质量和染色质量。手工制备血涂片应有恰当的羽状边缘，以便查找细胞；自动血涂片仪的制片和染色更一致。系统设计应能兼容各种染色方案，制造商可推荐特定的设置或提供仪器使用方案，以评价单个实验室目前使用的涂片制备/染色方案。这些系统的质控可采用临床实验室自制的血涂片作为质控涂片，对日内或日间染色和涂片质量进行评价。这些数字成像细胞定位/预分类系统的评估需包括下列性能：可重复性/精密度、准确度、可比性、诊断灵敏度和特异度。若有替代基于CLSI H20-A2文件的评估方案，经批准可用的细胞定位/预分类系统则可考虑将CLSI H20-A2文件作为细胞定位/预分类系统的参考方法。因细胞定位/预分类系统不能自动吸取血液，故携带污染、线性、空白限(limit of blank, LoB)/检出限(limit of detection, LoD)/定量限(limit of quantity, LoQ)就不适用于此类系统的评价。尽管标本稳定性对能否识别陈旧标本的细胞很重要，但无需严格用于数字细胞定位/预分类系统的评价。数字细胞定位/预分类系统很少受干扰(如缗钱状红细胞、红细胞聚集和血小板凝块等)，若存在典型的干扰物也多数是肉眼可见的。另外，必须用已安装的系统验证每个实验室手工或自动分类法建立的参考区间。(2)数字成像血液系统，即数字成像CBC/分类(differential, Diff)/Ret血液分析仪：可做CBC和正常白细胞五分类，有些仪器还可做Ret。当检出异常细胞时，仪器会报警，让有经验的检验人员进行复检。对数字成像系统识别CBC、正常白细胞和Ret来说，在使用前应对仪器所有的性能特征进行全面评估(目前，美国FDA尚未批准过任何系统)。各种类型的数字成像系统应测试的性能特征见表2。携带污染、线性、LoD和LoQ等性能特征的测试可在较常用方法的基础上改良，以适应数字成像系统与大多数“传统”电阻抗或光学法血液分析仪之间的差异。在某些系统上，携带污染的评估需要使用处理后的标本(如空白血清标本、商品化低值红细胞标本及乏白细胞和血小板标本)作为“高值”标本分析后的“低值”标本，以检测白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板携带污染。从低值标本中去除白细胞和血小板很难做到。应重视异常细胞的携带污染。影响电阻法或光学法血液分析仪的干扰物质(如脂血、胆红素血症、副蛋白血症等)不会影响数字成像检测CBC/分类(Diff)/Ret参数。缗钱状红细胞、冷凝集和RBC聚集等极端情况可能影响CBC、Diff和Ret结果，因此，需在分析前处理这些标本。评价时应包括形态学异常标本(见本刊2014年第29卷第12期第1204页表1)。“数字成像系统”血液分析仪和细胞/预分类系统的分析软件中都应包括这些异常情况(细胞)的识别或计数。

表2　数字成像血液分析系统需测试的性能特征

11. 流式细胞术免疫表型计数法流式细胞术是手工显微镜白细胞计数的一种替代方法，用造血白细胞不同标志物的特定单克隆抗体进行分类，预期不但能提高精密度和准确度，而且还可对显微镜不能识别的细胞做进一步分类，明显减少显微镜细胞分类的主观性。初步研究使用了3种不同组合的6色单克隆抗体和荧光色素。在ICSH的主持下，初步的研究结果表明，要获得新方法白细胞分类的预期性能特征需使用8种及以上的配色组合。免疫表型方法的特点是一次分析即能明确识别淋巴细胞(定义不同亚型)、单核细胞(活化、静止和未成熟)、粒细胞(成熟和未成熟)和浆细胞，同时计数原始细胞和有核红细胞。最终推荐的白细胞计数参考方法旨在作为替代CLSI H20-A2文件的更稳健的方法。目前，ICSH工作组正在用最新的“ICSH/ICCS细胞荧光检测确认指南”做进一步的评价和确认，研究使用的抗体组合方案见表3。

表3　单克隆抗体及DNA染料Syto16组合方案(按ICSH

12.异常细胞报警和细胞计数一样，细胞形态也需评估，并与仪器产生的可疑异常细胞报警的有效性进行比较。当白细胞、红细胞和血小板异常时，大多数仪器会报警。在其他情况下，产生的报警是提示仪器结果不可靠或错误，不应继续使用。理想的情况是仪器能识别异常细胞，以便进一步进行实验研究。根据Galen和Gambino的建议，应计算每个与形态学或出现异常细胞有关的单个报警的灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预期值和总有效率，且所有标本都需做血涂片检查。灵敏度是仪器显示异常标本阳性结果的能力，而特异度是仪器显示非异常标本阴性结果的能力。细胞形态分类有效性的评估见表4、表5。

13.质量保证参加经认证的室间质量评价(EQA)计划是有益的。EQA能显示该仪器与其他仪器进行比较的性能水平。EQA计划[包括美国病理学家学会(College of American Pathologists，CAP)、英国国家室间质量评价方案(United Kingdom National External Quality Assessment Service，UK NEQAS)或其他组织的方案]常使用部分或全部稳定化全血，因此，不能采用和新鲜血液相同的操作方法。EQA样品的检测结果通常具有仪器特异性，特别是白细胞分类计数、血小板和Ret。EQA是在多个实验室的仪器组之间，而不是在所有仪器组之间进行相互比较。通常由EQA组织方计算靶值和可接受限值并反馈给参加的实验室。所有可报告结果应有一个室内质控的设定值(厂商提供的稳定化全血)。目前，有些仪器的某些参数是不可信的，实验室管理者至少应考虑这些参数能否用于临床决策。理想情况下，EQA是真实的，但对仪器特定的参数或新的参数而言，并非都可行。值得注意的是，某些扩展参数，甚至是某些既定的参数，如NRBC、IG、平均血小板体积、未成熟血小板分数、未成熟网织红细胞分数和红细胞分布宽度等在许多国家没有可用的EQA计划。

表4　细胞形态分类有效性评估的计算

注：TP为真阳性；FP为假阳性；FN为假阴性；TN为真阴性

表5　细胞形态分类有效性的评估

14.血液分析仪地区性确认/转移在各种情况下，新系统都应与当前实验室内部正在使用的系统进行比较。在进行比较时应使用1套用于检测灵敏度、特异度、可重复性和结果稳健性的标本。如尚未按本指南所述做过完整的评估，则应进行文献检索，查找针对设备的独立的同行评议。确认/转移可定义为：建立文件化的证据，保证一个特定的流程将始终如一地产生符合其预定质量规格和质量属性的结果。在国家级评价期间，虽然已评估了仪器的精密度、与参考方法的可比性、线性、携带污染和偏移，但仍需对仪器有一个简单的确认和对参考区间的研究。总之，临床实验室应根据本文件前述的评估方案进行简单的确认，并有必要至少使用120例标本确定参考区间是否与现有仪器相同。如临床实验室检测新生儿或儿童标本还应独立进行评估。如儿童标本采用开盖模式检测，也应进行评估。许多血液分析仪可采用仪器特定稀释液稀释的毛细血管血液进行分析。血液稀释液各异，若在毛细血管模式下运行，通常仪器会计算全血结果。如临床实验室采用此模式，应至少使用30例标本与全血模式进行比较和评估。在任何评价开始前，最重要的是确保仪器符合临床实验室要求，其服务能达到预期的目的。评价人员应能获得下列信息：名称、仪器制造商和分销商、价目表(包括出租或租赁的选项、试剂和耗材成本)和服务合同。应核查仪器整体尺寸、电力需求、排液、操作环境(温度范围)和仪器产热性等。耗材(试剂、质控品、校准品)的信息、试剂配方和有效期、可能的测试量和测试数以及储存要求可作为仪器完整评价的一部分。此时，还应了解仪器与实验室/医院信息系统的连接能力、可用参数、检测原理、最小标本量、数据显示、与其它系统的兼容性等全部内容。新仪器产生的结果应与同一机构内其他仪器和即时检验(point-of-care testing，POCT)仪器已用的报告单位和参考区间具有可比性。仪器应能处理临床实验室最常接收到的各类试管。在评估计划中应包括获得相关标本、保养记录、结果分析、使用统计学处理和撰写最终报告所需的实际时间或周期。对贷款购买或租赁的仪器，此点尤为重要。应估计评估所需的试剂和耗材的量。在评估期间，对维修和保养的安排必须合适，若有可用的培训活动，则于评估前就应开始。制造商和供应商应签署在仪器安装后检测和校准均在预定范围内的声明。应选择恰当职级的检验人员来完成评估，并确保这些人员可用。应选择技能与设备均可能与用户相似的检验人员进行评估。买方应对仪器做地区性评价，并确认结果。在技术评估前，应要求制造商提供仪器安装、培训和适用的血液标本的初步信息。应建立书面方案，规定如何进行确认。首先，临床实验室应确定仪器的性能规格与制造商提供的证明相似甚至更好，且与之前公开报道的性能相比不分上下。仪器的地区性评价和分析也应考虑结果的可比性、参考区间、可靠性和可接受性，其评价方法应与国家级评价一样。与全面评价相比，进行性能确认只需较少的标本，但用于可比性和参考区间的确认至少需要50例标本。未来，将有更多的核心/中心实验室接收来自远程或运输时间达48 h的标本。应确认这些标本的结果，以保证提供给临床医生的结果是正确的，临床上使用这些结果是安全的。有些指南性文件，如CLSI H20-A2文件中白细胞分类参考方法规定仪器评价至少应包括200个标本(1/2正常、1/2异常)。规范的临床实验室应规定手工分类和自动分类的比较使用的标本量最低限度至少为50～100例(1/3～1/2为正常标本，其余为异常标本)。

15.效率(1)处理量：应记录每小时标本(包括质控物)的处理量。任何需时多于标准的CBC和白细胞分类的试验(如Ret)、某些分析仪对异常标本有选择另一检测通道、进行扩展计数或采用不同检测方法的反馈功能，这些时间均应加以考虑。还应测定仪器开机、关机和常规保养所需的时间。也应记录无论何种原因需重新检测的标本。(2)标本识别：目前，使用条码阅读器识别标本很普遍，这给临床实验室提供了明显的益处。但为了机动起见，应有手工录入患者信息和试验的程序。在评价期间，如条码用于标本识别，则还应评估和记录仪器条码读取的差错，避免这些差错影响仪器的效率。临床实验室应寻求有关信息技术的选择、中间件的可用性(仪器和实验室信息系统之间的软件通讯)和基于专家规则系统的结果自动审核或自动血片制备的信息。(3)结果显示和储存的信息技术：应确立仪器和医院信息系统，尤其是双向接口的兼容性。应评估数据显示和图形的质量和格式，包括质控结果的显示以及结果确认的处理、数据储存的能力、结果检索的速度和可用的质控计划。(4)培训：应明确制造商所提供的培训的质量，包括操作手册的易用性和清晰性。临床实验室应列出制造商的联系表，用于仪器升级、召回通知或技术更新。(5)可靠性：应记录仪器损坏而无法使用的持续时间以及制造商的维修响应时间。(6)价格：应确定每次测试的费用，包括质控品价格、操作人员保养和操作仪器的耗时以及从标本处理至报告最终解释所需的时间。(7)可接受性：应考虑员工的意见和喜好。应对检查仪器操作所需的专业水平及仪器对临床实验室流程和组织的影响进行评估。任何对临床实验室设计的修改均应予以考虑。正如本指南之前所述，应保存所有的评估记录。应确认制造商声明的批内、批间精密度。应使用异常标本和尽可能含有干扰物质的标本研究设备的适用性和与当前方法的可比性。应记录所产生的异常细胞报警和仪器因故障而不能提供结果的数量，并与现有的方法进行比较。地区性评价也应与国家级分析一样，考虑仪器的精密度、结果可比性、参考区间、可靠性和可接受性。一旦在数月内确认了设备，就应进行审核，确保设备符合制造商的所有声明、所报告的参数、任何中间件和信息系统均符合临床实验室需求。

16.POCT分析仪评价的特殊注意事项POCT可定义为在临床实验室以外的环境，由医护人员为患者所做的任何分析试验。POCT的设计是将实验室检测靠近患者，所提供的服务比来自中心实验室的服务更为快捷。从设计用于患者床边、重症监护室或手术室的手持式POCT设备到小型台式POCT分析仪，虽各不相同，但最终的检测结果均应附有参考区间，其结果与主要的血液分析仪应具有可比性。对现有一些采用毛细管血液检测白细胞和血小板的便携式血红蛋白仪和单独检测血红蛋白的血气分析仪，也应采用同样的方式进行评价。理想情况下，在一个机构不同地点需多台POCT仪器时，只能选择一种型号的仪器。这样患者才可能有相同的检测结果和参考区间；同时也简化了培训、试剂申请和储存以及服务和维护合同。之前，ICSH已发表了3篇有关POCT性能确认的全面综述。应在仪器将要放置的环境中检测设备的性能；检测应由将要操作的人员予以实施，从而确保证明由非检验人员使用的易操作性。现已证明熟练和不熟练的使用者之间的经验是不同的。通常POCT仪器用户的检测质量要逊于有经验的检验人员。

注：以上内容是ICSH工作组血液分析仪评价指南(已发表于《国际实验血液学杂志》2014年第6期[1])的译文，希望能对国内CFDA、检验界同行在评价和确认/验证血液分析仪的工作中会有所帮助，以提高我国血液分析仪整体评价水平。

参考文献

[1]International Council for Standardization in Haematology. ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting [J]. Int J Lab Hematol，2014，36(6)：613-627.

(本文编辑：龚晓霖)