淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞以及血浆IFN-γ和IL-10水平及其临床意义

张国英，　钮晓红，　徐卫平，　夏　厦

(南京中医药大学附属南京市中西医结合医院检验科,江苏 南京 210014)

淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞以及血浆IFN-γ和IL-10水平及其临床意义

张国英，钮晓红，徐卫平，夏厦

(南京中医药大学附属南京市中西医结合医院检验科,江苏 南京 210014)

摘要：目的研究淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞(Treg)和干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)水平的变化及临床意义。方法采用流式细胞仪对100例淋巴结核患者及30名正常人外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平进行检测。结果淋巴结核患者组与正常对照组比较，外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05)，而IFN-γ水平则降低(P<0.05)。在干酪样型、增殖型和混合型3种类型的淋巴结核病之间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论淋巴结核患者细胞免疫功能明显异常。CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10在淋巴结核的发病过程中发挥了重要作用。

关键词：CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞；干扰素γ；白细胞介素10；淋巴结核

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0031-05R446.63

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.008

Abstract:ObjectiveTo study the changes of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes (Treg) and interferon gamma (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10) levels of patients with lymph tuberculosis and their clinical significance. MethodsThe levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 of 100 lymph tuberculosis patients and 30 healthy subjects were determined by flow cytometry. ResultsCompared with the healthy controls, the levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg and IL-10 levels in lymph tuberculosis group increased with statistical significance (P<0.05), while IFN-γ level decreased (P<0.05). Among the caseous, proliferation and mixed types of lymph tuberculosis, there was no significant difference (P>0.05). ConclusionsCellular immune function is significantly abnormal in patients with lymph tuberculosis. CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 play important roles in the onset process of lymph tuberculosis.

基金项目：南京市医学科技发展项目(QYK11146)

作者简介：张国英，女，1978年生，硕士，副主任技师，主要从事微生物与免疫学研究。

收稿日期：(2014-01-21)

Levels of CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes in peripheral blood and plasma IFN-γ, IL-10 of patients with lymph tuberculosis and their clinical significanceZHANGGuoying,NIUXiaohong,XUWeiping,XIAXia.(DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,JiangsuNanjing210014,China)

Key words: CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocyte; Interferon gamma; Interleukin 10; Lymph tuberculosis

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，其中，淋巴结核病是指发生于全身淋巴结的结核病，如颈部淋巴结核、肠系膜淋巴结核等，约占结核病的10%。对这类结核病的研究，目前仍相对较少。临床上因此漏诊率、误诊率较高[1]。

结核分枝杆菌为胞内寄生菌，机体的免疫清除作用主要依赖于分泌干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)的CD4+和CD8+效应性T细胞。CD4+CD25highFoxP3+调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)是SAKAGUCHI等首先描述的在胸腺内发育成熟的抑制自身免疫和移植排斥反应的一群细胞，占CD4+T细胞总数的5%~10%[2]，能够分泌白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)等抑制因子，从而发挥免疫调节作用[3]。

本研究分别采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平，并探讨其临床意义。

材料和方法

一、研究对象

淋巴结核组：选取2012年4月至2013年4月在南京市中西医结合医院住院就诊的淋巴结核患者100例，男39例，女61例，年龄(44±17)岁，根据中华医学会2005年《临床诊疗指南·结核病分册》关于淋巴结核的诊断标准[4]确诊，并排除由瘰疬分枝杆菌等引起的非结核性分枝杆菌淋巴结炎患者。其中干酪样型21例、增殖型32例、混合型47例。正常对照组：选取健康体检者30名，其中男16名，女14名，年龄(37±19)岁。

二、标本采集

采集外周静脉血5 mL，肝素锂抗凝。分成2管，一管2 mL用于CD4+CD25highFoxP3+Treg检测，另一管及时分离血浆，贮存于-80 ℃冰箱，用于检测IFN-γ、IL-10水平。

三、方法

1. CD4+CD25highFoxP3+Treg的检测在2 mL肝素抗凝血中加入2 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)稀释全血，将全血混合液缓慢加至2 mL Ficoll液上，使其分层。1 000×g离心20 min，吸取中间白膜层单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，并用PBS洗涤1次(600×g离心5 min)。每管加入100 μL制备好的PBMC(1×106/mL)，并加入20 μL CD4-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate,FITC)/CD25-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)混合液，4 ℃下避光孵育30 min；经流式染色缓冲液洗涤后加入1 mL Fixation/Permeabilization缓冲液，4 ℃下避光孵育45 min破膜。用破膜缓冲液洗涤2次后加入20 μL FoxP3-藻红蛋白-菁蓝色素荧光素(phycoerythrin cyanine 5,PECy5)(同型对照管加入20 μL IgG2a-PECy5)，于4 ℃避光孵育30 min。经破膜缓冲液洗涤2次后用500 μL 流式染色缓冲液重悬，上流式细胞仪(FACS Canto Ⅱ型，美国BD公司)检测。

2. IFN-γ、IL-10的检测用ELISA进行检测，试剂盒购自法国DIACLONE公司，用BIO-RAD EVOLIS全自动酶免疫分析仪进行测定。

四、统计学方法

结果

一、 淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

与正常对照组比较，淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05)，而IFN-γ水平则降低(P<0.05)。 见表1、图1和图2。

二、不同类型淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

干酪样型、增殖型和混合型淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg、IFN-γ和IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1淋巴结核组及正常对照组外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10的水平比较

组别 例数CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)淋巴结核组1002.32±0.2916.62±1.6316.74±2.21正常对照组302.01±0.4919.07±2.8514.50±1.56

注：与正常对照组比较，*P<0.05

图1　淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式图

图2　正常对照组外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式图

组别 例数CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)干酪样型组212.29±0.5216.28±0.7517.05±2.13增殖型组322.36±0.1417.19±3.3516.01±2.45混合型组472.31±0.3016.51±1.6216.95±2.09

讨论

MTB是一种胞内寄生菌。机体在抵抗MTB感染的过程中，细胞免疫应答发挥着重要作用，对结核病的发生、发展和转归具有决定性意义[5]。而决定细胞免疫强弱的主要因素是血液中T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的水平[6]。

CD4+CD25highFoxP3+Treg是一群具有免疫抑制效应的T细胞亚群[7-9]，在调节自身反应性T细胞的功能，维持机体免疫平衡和自身耐受，防止自身免疫性疾病发生过程中起着重要作用。其数量和功能缺陷会导致自身免疫性疾病，而数量和功能过度，则会抑制效应T细胞的功能而导致肿瘤等疾病的发生[8]。 本研究分析了100例淋巴结核患者外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg的水平，发现与正常对照组相比，淋巴结核患者的CD4+CD25highFoxP3+Treg明显升高，提示淋巴结核患者由于CD4+CD25highFoxP3+Treg的数量增加，抑制了体内T效应细胞的功能，从而使CD4+CD25highFoxP3+Treg参与淋巴结核病的发生。

IFN-γ是一个由辅助T细胞(help T cell, Th)1分泌的重要细胞因子[10-11]，能激活巨噬细胞，增加它们对MTB的杀菌能力，在局部抗结核感染的防御机制中起重要作用[12]。IL-10对免疫系统的调节作用主要表现为2个方面，一方面具有抑制细胞免疫的作用，即通过对Th发挥作用，抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌[13]。另一方面，IL-10还能促进Th0向Th2转化，诱导B淋巴细胞增殖分化，介导体液免疫。Th2的增高可下调Th1反应，抑制IFN-γ产生[14]。因此，IL-10可抑制细胞介导的抗MTB感染免疫反应[15]。本研究通过检测淋巴结核患者外周血IFN-γ、IL-10的水平发现，与正常对照组相比，淋巴结核患者的IFN-γ水平显著下降，而IL-10的水平显著上升。提示在淋巴结核患者体内，CD4+CD25highFoxP3+Treg通过分泌IL-10等抑制性细胞因子，间接抑制IFN-γ等的水平，进而发挥免疫抑制功能，导致机体细胞免疫功能下降，引起MTB在体内的慢性持续感染。

淋巴结核按病理学分型可分为3种类型：干酪样型、增殖型和混合型。本研究分别对3种类型的淋巴结核患者进行外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平的检测，发现3种类型之间无明显差异。进一步表明在淋巴结核病的发病过程中，CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10发挥了重要作用。本研究因检测例数不多，故未按不同的病程、治疗方案等分组进行比较，今后仍需进一步收集资料进行研究。

综上所述，通过对淋巴结核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg以及血浆IFN-γ和IL-10水平的检测，发现淋巴结核患者的细胞免疫功能明显异常，在MTB感染引起淋巴结核的过程中，CD4+CD25highFoxP3+Treg和细胞因子IFN-γ、IL-10发挥了重要作用。

参考文献

[1]胡忠义,王洪生. 肺外结核病的实验室诊断技术应用[J]. 中华结核和呼吸杂志，2008，31(2): 92-94.

[2]SAKAGUCHI S, SAKAFUCHI N, ASANO M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151-1164.

[3]STRAUSS L, BERGMANN C, SZCZEPANSKI M, et al. A unique subset of CD4+CD25 high FOXP3+ T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-beta 1 mediates suppression in the tumor microenvironment[J]．Clin Cancer Res,2007,13(15 Pt 1):4345-4354．

[4]中华医学会.临床诊疗指南·结核病分册[M].北京：人民卫生出版社，2005:27-28.

[5]MINER MD, CHANG JC, PANDEY AK, et al. Role of cholesterol inMycobacteriumtuberculosisinfection[J]. India J Exp Biol,2009,47(6):407-411.

[6]KOYBASI S, SAYDAM L, GUNGEN Y. Histiocytic necrotizing lymphadenitis of the neck [J]． Am J Otolaryngol, 2003,24(5):344-347．

[7]SAKAGUCHI S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+ CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self[J]. Nat Immunol, 2005, 6(4): 345-352.

[8]DASGUPTA A, SAXENA R. Regulatory T cells: a review[J]. Natl Med J India, 2012,25(6):341-351.

[9]LEE J, CHOI YS, SHIN EC. Ribavirin does not impair the suppressive activity of Foxp3(+)CD4(+)CD25(+) regulatory T cells[J]. Immune Netw, 2013,13(1):25-29.

[10]陈永琴,金文君，戴梦璐. 慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平检测与病毒载量的关系[J]. 检验医学，2013，28(4):315-317.

[11]LATIFYNIA A, KHAMISIPOUR A, GHARAGOZLOU MJ, et al. Post challenging serum cytokine profile (Th1 & Th2) in the vaccinated mice (Balb/C) with a new formulation of leishmania major antigen[J].Turkiye Parazitol Derg, 2013,37(4):233-240.

[12]XIONG L, XIANG F, ZHOU Q, et al. Effects of different cytokines on proliferation and apoptosis of pleural mesothelial cells in humanMycobacteriumtuberculosisinfection[J].Zhonghua Jie He Hu Xi Za Zhi,2013, 36(5) :341-345.

[13]LOSER K, APELT J, VOSKORT M, et al. IL-10 controls ultraviolet-induced carcinogenesis in mice[J]. J Immunol,2007,179(1):365-371.

[14]薛祖洪，刘灿均，周明先，等.T淋巴细胞亚群及细胞因子检测在结核病诊治中的应用[J]. 实用临床医药杂志，2011,15(1):121-122.

[15]DE LA BARRERA S, ALEMAN M, MUSELLA R, et al. IL-10 down-regulates costimulatory molecules onMycobacteriumtuberculosis-pulsed macrophages and impair the lytic activity of CD4 and CD8 CTL in tuberculosis patients[J].Clin Exp Immunol,2004,138(1):128-138.

(本文编辑：姜敏)