乳胶增强免疫散射比浊法检测血清淀粉样蛋白A的应用评价

姜剑巍，　杨　宇，　应春妹

(1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127；

2.上海奥普生物医药有限公司，上海 201203；3.复旦大学附属妇产科医院，上海 200011)

乳胶增强免疫散射比浊法检测血清淀粉样蛋白A的应用评价

姜剑巍1，杨宇2，应春妹3

(1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127；

2.上海奥普生物医药有限公司，上海 201203；3.复旦大学附属妇产科医院，上海 200011)

摘要：目的建立乳胶增强散射免疫比浊法检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的即时检验(POCT)方法，并对该法的精密度、线性、准确度等进行评价。方法建立乳胶增强免疫比浊法测定SAA的POCT方法，并根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)相关文件对建立的POCT方法进行方法学评价。结果本法的分析灵敏度为3.52 mg/L；批内变异系数(CV)<8%、日间CV<10%；抗干扰性较强，血红蛋白≤4.0 g/L、胆红素≤400 μmol/L、类风湿因子≤1 621 U/L、甘油三酯≤10 mmol/L对测定无影响；与进口N Latex SAA试剂相关性良好(Y=1.052 1X+0.001 5，r=0.998 3)；线性范围为5～200 mg/L。结论本法具有简单、快速(3 min内完成检测)的特点，各项分析指标均符合要求，可用于临床患者血清标本的检测。

关键词：淀粉样蛋白A；血清；乳胶增强免疫比浊法；即时检验

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0049-04R446.1

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.012

Abstract:ObjectiveTo establish the analysis performance of serum amyloid A (SAA) detected by latex-enhanced immunonephelometry method with point-of-care test (POCT), and to evaluate precision, linearity, accuracy and so on. MethodsAccording to relevant documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)， the methodological evaluation was performed. ResultsThe sensitivity of this method was 3.52 mg/L. The within-run and inter-day coefficients of variation (CV) of this method were <8% and <10%, respectively, with strong anti-interference ability. When the level of hemoglobin was ≤4.0 g/L, the level of bilirubin was ≤400 μmol/L, the level of rheumatoid factor was ≤1 621 U/L, and the level of triglyceride was ≤10 mmol/L, there was no influence on the results. There was a good correlation with that of imported N Latex SAA assay (Y=1.052 1X+0.001 5, r=0.998 3). The detection linear range of this method was 5-200 mg/L. ConclusionsThe latex-enhanced immunonephelometry method for SAA is convenient, and it can be finished within 3 min. Its performance meets the requirements for in vitro diagnostic reagents, and it is suitable for the detection of serum samples in clinical use.

作者简介：姜剑巍，男，1983年生，主要从事临床检验工作。

通讯作者：应春妹，联系电话：021-63455050。

收稿日期：(2014-02-17)

Application evaluation of latex-enhanced immunonephelometry method to determine serum amyloid AJIANGJianwei1，YANGYu2，YINGChunmei3.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，RenjiHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200127，China; 2.ShanghaiUpperBio-TechPharmaCo.，Ltd.，Shanghai201201,China; 3.ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200011,China)

Key words: Amyloid A；Serum；Latex-enhanced immunonephelometry method；Point-of-care test

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein ，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子质量约为12 000。在急性时相反应中，经白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100～1 000倍。与C反应蛋白 (C reactive protein，CRP) 类似，SAA是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。研究表明在病毒感染性急性期，SAA水平明显升高，而CRP升高并不明显，因此SAA是判断病毒感染灵敏而可靠的指标[1-3]。SAA和CRP联合检测有助于患者细菌感染和病毒感染的鉴别诊断。另外，SAA在诊断病毒感染、肾移植排斥反应患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面比CRP更敏感[4-6]。

目前，已有许多方法应用于血清SAA的检测，包括放射性免疫检测法、酶联免疫吸附试验、免疫速率散射比浊法和微球捕获酶免疫法等[7]。这些方法具有较好的敏感度和特异性，可用于自动化分析。但是，目前通过中国食品药品监督管理局(CFDA)审批的SAA试剂盒只有西门子公司一家，难以满足市场需求。为此，我们建立了乳胶增强散射免疫比浊法测定SAA的即时检验(point-of-care testing，POCT)方法，并评价其各项性能指标以及在临床检测应用中的可行性。

材料和方法

一、材料

1. 试验材料SAA多抗购自丹麦Dako公司；SAA校准品购自英国国家生物制品鉴定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC; NIBSC code:92/680)，使用时稀释至相应浓度；羧化聚苯乙烯乳胶微球由上海奥普生物医药有限公司通过乳液聚合方法制备。

2. 试剂和仪器西门子BNProspec特定蛋白分析仪及配套N Latex SAA试剂盒由德国西门子公司生产。F1多通道散射免疫浊度分析仪(简称F1免疫分析仪，注册号：沪食药监械(准)字2013第2400203号)由上海奥普生物医药有限公司生产。CP70ME超速离心机由日本日立公司生产。

3. 研究对象40例患者血清标本来自上海交通大学医学院附属仁济医院门诊及住院患者。

二、POCT方法的建立

1. 羧化聚苯乙烯乳胶微球的合成根据文献[8]的方法合成羧化聚苯乙烯乳胶微球。

2. SAA多抗与羧化聚苯乙烯微球的连接将1 mL 10%粒径大小为80 nm的羧化聚苯乙烯微球用10 mL 0.1 mol/L 2-N-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH值6.0)稀释，加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液1 mL，活化15 min。加入10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液1 mL，室温下反应1 h，以64 400×g离心1 h，去上清，沉淀用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS; pH值7.2)悬浮并超声分散均匀。5 mg SAA多抗用0.05 mol/L PBS(pH值7.2)稀释后加入到超声分散好的羧化聚苯乙烯乳胶微球溶液中，室温下反应24 h，用封闭缓冲液[0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH值8.0)、0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)]封闭1 h，64 400×g离心，用洗涤缓冲液[0.05 mol/L Tris溶液(pH值8.0)]洗涤2次，64 400×g离心，去上清，沉淀部分用30 mL恢复液[0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]恢复，超声分散均匀得到包被了SAA多抗的乳胶微球，即为试剂2。测定校准品，根据测定值在仪器上的反应性能，调整PEG6000的含量，配制成相应的试剂1[除PEG含量调整外，其余配方为0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]。

3. 标准曲线的确定SAA高值血清分别稀释到5、10、50、100、150、200和250 mg/L，每个浓度测定3次，取平均值与仪器检测值做标准曲线。

4. 操作步骤的确定在比色杯中预先分装500 μL试剂1，加入5 μL测试样品，然后加入85 μL试剂2，混匀，在5 s内将比色杯插入F1免疫分析仪中，仪器自动识别比色杯的插入并开始自动检测，每10 s测定一次散射值，取70 s和10 s散射值的差值与样品浓度做标准曲线。

三、性能分析

3. 准确度回收试验根据文献[11]配制系列浓度回收血清样品，每份样品测定3次，结果取其平均值，计算回收率。

4. 干扰试验向正常人混合血清中加入不同浓度胆红素(bilirubin，Bil)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)，评价检测方法抗黄疸、脂血、溶血干扰的能力。另外加入对比浊法试剂影响较大的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，评价检测方法对RF的抗干扰能力。Bil和TG为纯品，购自国药集团化学试剂有限公司，使用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后与正常人血清混合。RF和Hb样品来自上海交通大学医学院附属仁济医院住院患者，其RF和Hb浓度经西门子BNProspec特定蛋白分析仪和配套试剂盒测定得到。

5. 对比试验将40例收集的临床血清随机分成5组，每天用本法和N Latex SAA试剂分别测定1组(8份)血清样品，每份血清样品测定2次，连续测定5 d，每种方法得到80个数据[12]。

6. 线性范围测定按照CLSI EP6-P文件做线性评价。取一高浓度标准品(200 mg/L)和一低浓度标准品(5 mg/L)，然后把两份样品等体积混合产生中间浓度值的样品，再分别将中间浓度值的样品和高低浓度值的样品混合，共产生了5个浓度值的样品。在F1免疫分析仪上用本法对5个不同浓度的样品分别平行测定5次，对数据进行统计处理，得到该检测方法的线性范围。

四、统计学方法

采用SPSS 10.0和Microsoft Excel 2007软件进行统计分析。采用配对t检验对两种方法的SAA结果做回归和相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、方法检测参数

1. 基本特性由于在F1免疫分析仪中的检测时间只有70 s，加上加入样品和试剂2的时间，单个样品的检测时间总共不超过3 min。

2. 标准曲线标准曲线公式为一元二次方程Y=-0.251X2+126.7X+87.89，R2=0.998，见图1。该曲线为SAA浓度为0～250 mg/L时的标准曲线；当样品SAA>250 mg/L时，需将样品稀释后再测。

图1　SAA标准曲线

二、检测方法的分析性能

1. 分析灵敏度零参考标准品测定10次的平均值加上2倍的标准差所得值为530.76，将其作为Y值代入标准曲线方程，得X值为3.52。所以本法的分析灵敏度为3.52 mg/L。

2. 精密度批内精密度和日间精密度结果见表1。

3.回收试验本法的回收率为93.21%。

4.干扰试验Bil≤400 μmol/L、Hb≤4.0 g/L、TG≤10 mmol/L、RF≤1 621 U/L对本法测定SAA无影响。见表2。

表1　批内和日间精密度结果

表2　本法测定SAA的干扰试验结果

5. 对比试验方法学比对结果显示本法和N Latex SAA试剂测定40例患者SAA的检测值主要落在5.12～185.67 mg/L之间。两种方法的相关系数(r)=0.998 3，P>0.05，见图2。对两种方法的测定数据进行Bland-Altman分析，结果见图3。从图3可以看出，有10%(4/40)的点在95%一致性界限以外；在一致性界限以内，两种方法差值的最大值为9.21 mg/L，两种方法测定结果的平均值为50.81 mg/L。这种相差的幅度在临床上可以接受。因此两种方法测定的结果具有一致性，在临床上可以互相替代使用。

图2　本方法测定值与N Latex SAA试剂盒测定SAA比较

图3　两种方法SAA测定值的Bland-Altman图

6. 线性范围本法线性范围为5～200 mg/L，其回归方程的截距和斜率分别为a=1.022 8、b=0.032 6，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4　本法线性范围

讨论

目前在国内已注册的SAA试剂盒很少，限制了SAA在临床上的应用。本研究建立的SAA POCT测定方法是通过将SAA多抗共价包被到羧化聚苯乙烯乳胶微球的表面，并优化配方制备得到了稳定的免疫乳胶试剂，与F1免疫分析仪配套使用，可在3 min内给出SAA的定量结果，且只需要5 μL血清，是一种快速测定SAA的POCT方法，可满足医院快速检测SAA的需要。

为了评价本法测定SAA的效果，本研究对方法的分析灵敏度、重复性试验、回收试验、干扰试验和线性范围进行了分析。本法的分析灵敏度为3.52 mg/L，可满足临床检测的需要；批内、天间CV均<10%，符合POCT体外诊断试剂CV须<15%方可用于临床患者样品检测[10]的要求；本法的抗干扰能力较强，RF含量高达1 621 U/L对检测也无影响；线性范围为5～200 mg/L，在这个区间内可以真实地反映患者SAA的水平。对比试验显示本法和N Latex SAA试剂在5.12～185.67 mg/L范围内相关性较好，两种方法之间差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，本研究建立的SAA检测方法的各项分析性能指标符合相关要求，具有简单、快速的优点，可满足临床日常检测的需求。

参考文献

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(本文编辑：龚晓霖)