miR-4429通过MTDH抑制前列腺癌细胞增殖、迁移与侵袭

俞 莹， 李建杰， 李汉华， 黄 娟， 翁文浩， 陈学飞

（同济大学附属杨浦医院检验科，上海 200090）

前列腺癌是男性最常见的癌症之一，在美国男性癌症相关死亡中居第2位[1]。随着我国人口老龄化的发展，前列腺癌的发病率逐年升高[2]。尽管雄激素剥夺疗法、放疗和外科手术在前列腺癌的临床治疗方面取得了一定的进展，但前列腺癌的发病率和死亡率仍较高[3]。目前，靶向治疗作为前列腺癌的一种重要且有效的治疗策略受到越来越多的关注。了解前列腺癌进展的分子基础可为前列腺癌的治疗提供新的策略。微小RNA（microRNA，miR）是一类由21～24个核苷酸组成的高度保守的非编码单链RNA，在癌细胞增殖、分化、侵袭和转移等一系列生物学过程发挥着重要的调控作用，被视为肿瘤发生和发展的重要参与者。有研究结果显示，微小RNA-4429（microRNA-4429，miR-4429）与宫颈癌[4]、多形性胶质母细胞瘤[5]、胃癌[6]以及甲状腺乳头状癌[7]有关，主要起抑癌作用，但在前列腺癌中的作用尚未见报道。异黏蛋白（metadherin，MTDH）被发现在神经胶质瘤[8]等多种肿瘤中呈高表达。miRNA靶标预测分析结果显示，miR-4429与MTDH的3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）存在靶向结合位点[9]。本研究拟探讨miR-4429在前列腺癌细胞系中相对表达量的变化及其对癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂

miR-4429模拟物（miR-4429 mimic）、miR-4429抑制物（miR-4429 inhibitor）、模拟物阴性对照（mimic NC）和抑制物阴性对照（inhibitor NC）购自上海吉玛制药公司。Trizol试剂、RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix）购自南京诺唯赞生物科技有限公司。兔抗MTDH单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔（鼠）IgG抗体及Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司。CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。Transwell小室（8 μm）和Matrigel基质胶购自美国Corning公司。pmirGLO荧光素酶报告载体及MTDH过表达载体的构建由通用生物系统（安徽）有限公司完成。

1.2 细胞来源和培养

人前列腺癌细胞系DU145、22rv1、PC3、LNCaP、VCaP和人前列腺上皮细胞系RWPE-1均购自美国典型培养物保藏中心。RWPE-1细胞采用含L-谷氨酰胺的F12K细胞培养基（美国Gibco公司）培养；DU145、PC3、LNCaP、22rv1细胞均采用RPMI 1640培养基（美国Invitrogen公司）培养，VCaP细胞采用Dulbecco改良Eagle培养基（美国Invitrogen公司）培养。所有培养基均补充青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L和10%胎牛血清。所有细胞放置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度恒温箱中常规培养。

1.3 RT-qPCR检测miR-4429及MTDH的相对表达量

按TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA，RNA纯度和浓度测定合格后，使用逆转录试剂盒合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。以cDNA为模板，分别按照miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书配置miR-4429及MTDH反应体系，反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸25 s，共40个循环。检测仪器为ABI 7900实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。miR-4429以U6作为内参基因，MTDH以GAPDH作为内参基因。miR-4429上游引物为5′-CGCGAAAAGCTGGGCTGA-3′，下游引物为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；MTDH上游引物为5′-TGTTGAAGTGGCTGAGGG-3′，下游引物为5′-CAGGAAATGATGCGGTTG-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，GAPDH上游引物为5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物为5′-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3′，根据2-ΔΔCt法计算miRNA-4429和MTDH的相对表达量。

1.4 细胞转染

将PC3细胞接种于6孔细胞培养板，培养至细胞融合度达60%～70%时进行细胞转染。按Lipofectamine 2000说明书分别将miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC转染至PC3细胞，转染24 h后，采用RT-qPCR检测miR-4429的相对表达量，确定转染效率。

1.5 细胞增殖能力检测

采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。收集转染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、阴性对照mimic NC和inhibitor NC的PC3细胞，按2 000个细胞/孔的密度分别接种于96孔板，每组设置6个复孔，每孔加入10 μL CCK-8反应液，37 ℃孵育，接种细胞后12、24、36、48、60 h，通过Multiskan Sky全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）测定450 nm波长处各孔不同时间点的吸光度（A）值，绘制增殖曲线。

1.6 集落形成试验

收集转染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3细胞，收集转染mimic NC、miR-4429 mimic、过表达空载质粒（Vector）、MTDH过表达质粒（MTDH OE）以及共转染miR-4429 mimic和MTDH过表达质粒（MTDH OE+miR-4429 mimic）的PC3细胞，按2×103个细胞/孔的密度加到6孔板中，再加入新鲜RPMI 1640培养基，2 d更换1次，培养14 d后弃去培养液，用4%多聚甲醛固定20 min，弃去固定液，加2 mL结晶紫染液，染色30 min，用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）洗涤后干燥30 min，拍照后用Image J软件（美国国立卫生研究院）计数细胞克隆数。

1.7 细胞迁移能力检测

收集转染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3细胞，收集转染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共转染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3细胞，使用RPMI 1640无血清培养基重悬PC3细胞，并调整细胞密度至5×105/mL，将200 μL PC3细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。取出Transwell小室，用棉签轻轻擦弃小室上层的细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色1 h，PBS洗涤，在CKX-53型显微镜（日本奥林巴斯公司）下随机选5个高倍镜视野拍照，并进行细胞计数。

1.8 基质胶侵袭试验

将基质胶均匀铺于Transwell小室上室并过夜成膜。收集转染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3细胞，收集转染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共转染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3细胞，并用RPMI 1640无血清培养基重悬，制备单细胞悬液，取1×105个细胞的细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，培养24 h后用棉签轻轻擦弃小室上层的细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色1 h，PBS洗涤，在CKX-53型显微镜下随机选5个高倍镜视野拍照，并进行细胞计数。

1.9 靶基因预测

采用TargetScan 7.0数据库（ http：//www.targetscan.org/vert_72/）和miRanda数据库（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）对miR-4429的靶基因进行预测，综合分析选取具有代表性的靶基因进行靶点验证。

1.10 荧光素酶报告基因分析

将野生型或突变型（突变M T D H与miRNA-4429结合位点）的MTDH3′UTR片段分别克隆到pmir GLO荧光素酶报告载体中。MTDH3′UTR-野生型和MTDH3′UTR -突变型荧光素酶报告基因质粒和内参质粒[海肾荧光素酶（Renilla luciferase，Rluc）]分别与miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC或inhibitor NC共转染。48 h后按照Dual Luciferase Reporter Assay System说明书进行操作，使用Promega GloMax 20/20发光检测仪（美国Promega生物公司）对萤火虫荧光值和Rluc荧光值进行测定。以Rluc荧光作为内参对各组测定结果进行均一化处理。以萤火虫荧光值/Rluc荧光值的比值作为目的荧光素酶报告基因的相对荧光素酶活性。

1.11 MTDH蛋白相对表达量检测

收集RWPE-1细胞和PC3细胞，收集转染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3细胞，收集转染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共转染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3细胞，使用RIPA裂解液（含5%蛋白酶抑制剂）（北京索莱宝科技有限公司）提取总蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定各组的蛋白质浓度。每个样本的蛋白上样量为40 μg，采用10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）进一步分离蛋白，通过湿转法将产物转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%封闭液封闭1 h后，使用三羟甲基氨基甲烷-吐温（tris-hydroxymethyl aminoethane-Tween，TBST）缓冲液洗3遍，每次10 min，加入一抗MTDH（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），置于4 ℃摇床孵育过夜，TBST缓冲液洗3遍，每次10 min，分别加入HRP标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000），室温孵育1 h后使用ECL显影液显影，采用Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能公司）进行成像分析。采用Image J软件对条带进行灰度统计。

1.12 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。所有试验均独立重复3次。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同人前列腺癌细胞系中miR-4429的相对表达量和miR-4429的转染效率

人前列腺癌细胞系DU145、22rv1、PC3、LNCaP和VCaP的miR-4429相对表达量显著均低于人前列腺上皮细胞系RWPE-1（P＜0.05），其中PC3细胞miR-4429相对表达量降低最为显著（P＜0.01），见图1。因此，细胞转染试验以PC3细胞为研究对象。

图1 不同人前列腺癌细胞系和人前列腺上皮细胞系RWPE-1中miR-4429的相对表达量

将miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC分别转染至PC3细胞中。miR-4429 mimic组（过表达miR-4429）miR-4429相对表达量明显高于mimic NC组（P＜0.01）。miR-4429 inhibitor组（抑制miR-4429表达）miR-4429相对表达量显著低于inhibitor NC组（P＜0.01）。见图2。

图2 各组miR-4429相对表达量比较

2.2 miR-4429对PC3细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

培养48和60 h时，miR-4429 mimic组PC3细胞的增殖能力明显低于mimic NC组（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor组的增殖能力显著高于inhibitor NC组（P＜0.01）；见图3（a）。miR-4429 mimic组细胞克隆形成数目明显低于mimic NC组，而miR-4429 inhibitor组细胞克隆形成数目高于inhibitor NC组，见图3（b）。迁移试验结果显示，miR-4429 mimic组PC3细胞迁移数目明显低于mimic NC组（P＜0.01）；而miR-4429 inhibitor组PC3细胞迁移数目明显高于inhibitor NC组（P＜0.01）；见图3（c）、图3（d）。侵袭试验结果显示，miR-4429 mimic组侵袭细胞数目低于mimic NC组（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor组侵袭细胞数目高于inhibitor NC组（P＜0.01） ；见图3（e）和图3（f）。

图3 miR-4429对PC3细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

2.3 miR-4429靶基因的预测结果

生物信息学软件预测结果显示，MTDH可能是miR-4429作用的靶基因。miR-4429与MTDH的3′UTR区序列互补的结合位点见图4（a）。荧光素酶报告基因试验结果显示，在MTDH3′UTR-野生型中，miR-4429 mimic组荧光素酶活性显著低于mimic NC组（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor组荧光素酶活性显著高于inhibitor NC组（P＜0.01）。在MTDH3′UTR-突变型中，无论转染miR-4429 mimic还是miR-4429 inhibitor，其荧光素酶活性均无明显变化（P＞0.05）。见图4（b）。

图4 miR-4429与MTDH的结合点及荧光素酶报告基因试验结果

2.4 miR-4429对MTDH表达的影响

PC3细胞MTDHmRNA和蛋白的相对表达量显著高于RWPE-1细胞（P＜0.01），见图5（a）和图5（b）。在PC3细胞中，miR-4429 mimic组MTDHmRNA和蛋白的相对表达量显著低于mimic NC组（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor组MTDHmRNA和蛋白的相对表达量显著高于inhibitor NC组（P＜0.01）；见图5（c）和图5（d）。

图5 miR-4429对MTDH mRNA和MTDH蛋白表达的影响

2.5 过表达MTDH对PC3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

miR-4429 mimic组克隆形成数目、MTDH蛋白的相对表达量、迁移和侵袭细胞数目低于mimic NC组。MTDH OE组克隆形成数目、MTDH蛋白的相对表达量、迁移和侵袭细胞数目高于Vector组（P＜0.01）。MTDH OE+miR-4429 mimic组的克隆形成数目、MTDH蛋白的相对表达量、迁移和侵袭细胞数目均高于miR-4429 mimic组（P＜0.01）。见图6。

图6 过表达miR-4429或MTDH对PC3细胞增殖，迁移和侵袭的影响

3 讨论

目前，前列腺癌发生的原因和机制尚未被完全阐明。探讨前列腺癌的发生、发展机制，寻找新的治疗靶点，对于延缓前列腺癌的发展，提高前列腺癌患者生存率有重要意义。miRNA在肿瘤细胞增殖、迁移、分化、侵袭和耐药等一系列生物学进程中扮演着重要的角色。有研究发现，miR-4429通过靶向DNA损伤修复的关键因子RAD51，提高了宫颈癌细胞对放疗的敏感性[5]；还可通过靶向CDK6，抑制肾透明细胞癌的进展和上皮-间质转化[10]。血清miRNA微阵列分析结果显示，hsa-miR-4429通过调控靶基因在胆道闭锁进程中发挥重要作用，或可作为诊断胆道闭锁的生物标志物[11]。急性缺血性卒中患者miR-4429表达量显著降低，参与调节免疫细胞基因的表达[12]。miR-4429在宫颈癌组织和细胞中呈低表达，起抑癌作用[13]。本研究结果显示，miR-4429在前列腺癌细胞中呈低表达，PC3细胞的表达量最低，miR-4429过表达可显著抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而抑制miR-4429表达则可促进PC3细胞的增殖、迁移和侵袭。这些结果说明miR-4429可以抑制前列腺癌细胞增殖，迁移和侵袭。因此，miR-4429在前列腺癌的发生、发展中起抑制作用。

有研究结果表明，MTDH是一种促癌基因，且受多种miRNA的调节。MTDH可通过激活葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1（staphylococcal nulcease domain containing 1，SND1）介导的细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信号通路和上皮-间质转化，促进肾透明细胞癌的转移[14]。敲除MTDH可降低卵巢癌细胞的增殖、转移能力[15]。由此可见，MTDH具有致癌作用，可作为抗肿瘤治疗的靶点。在结直肠癌中，MTDH是miR-182-5p的功能靶点，miR-182-5p靶向MTDH可抑制结直肠癌细胞的增殖和转移[16]。有研究结果显示，miR-154可通过抑制MTDH的表达来抑制胃癌细胞的增殖[17]。本研究采用荧光素酶报告基因试验验证了miR-4429靶向结合MTDH，并且miR-4429的过表达可显著抑制MTDH的转录和蛋白表达。将miR-4429 mimic和MTDH共转染PC3细胞，结果显示，miR-4429对PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用被逆转。提示miR-4429的下调可能会促进MTDH表达，进而促进前列腺癌的发展。

综上所述，miR-4429可抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭，其作用机制与靶向负调控MTDH的表达有关。