RNase H依赖性PCR技术及其应用研究进展

吴新新， 韩明月， 余道军

（1.浙江中医药大学第四临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

聚合酶链反应（polymerase chain raction，PCR）通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入正反向引物、DNA聚合酶、dNTP实现特定基因的体外复制，充分利用了碱基互补配对、双链性质、DNA分子熔解温度的优势[1]，因其特异性强、灵敏度高、简便、快速、纯度要求低等优点，成为生命科学和医学检验常用的技术之一。随着医学技术的发展，更加特异、灵敏和准确的核糖核酸酶H依赖性聚合酶链反应（ribonuclease H-dependent polymerase chain reaction，rhPCR）技术被DOBOSY等[2]开发出来。rhPCR在传统PCR原理的基础上，使用了一种封闭式可切割的rhPCR引物。rhPCR引物在反应初始不具备延伸的能力，只有在与目标DNA碱基序列互补时才能被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）H消化，从而获得延伸的能力，启动扩增反应[3]。rhPCR能够有效解决PCR中引物二聚体形成和脱靶扩增的问题[4]，提高反应的特异性。rhPCR在拥有高度特异性的同时，灵敏度和准确性相对于传统PCR都有明显提高[5]，在单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）[6]、多重靶分子、具有密切相关序列的靶标及低水平靶分子检测等方面具有较大优势。本文对rhPCR的体系组成、关键酶、rhPCR引物设计方法、具体应用和发展前景作一综述。

1 rhPCR的关键技术

rhPCR在常规PCR扩增体系的基础上增加了RNase H2酶、正反rhPCR引物。具体的扩增体系包括10×扩增缓冲液、Mg2+、甜菜碱、RNase H2、4种dNTP混合物、正反rhPCR引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板。

1.1 RNase H2

RNase H普遍存在于各种生物中，主要分为2个家族，目前根据其氨基酸序列的不同分为RNase H1型和RNase H2型。RNase H1包括细菌RNase HⅠ、哺乳动物RNase HⅡ、逆转录酶的RNase H域和古细菌RNase HⅠ，RNase H2包括细菌RNase HⅡ、细菌RNase HⅢ、哺乳动物RNase HⅠ和古细菌RNase HⅡ[7]。RNase H1的反应底物至少需要3个连续的RNA残基，其中对4个连续RNA残基的底物才具有较高的催化活性，不能切割单个RNA残基，使其应用受限。

rhPCR通常使用来自深渊热球菌的RNase H2[8]，这是一种核糖核酸内切酶，具有从基因组DNA中去除单个核糖核苷酸的独特作用[9]。rhPCR利用了RNase H2的特殊性质，即可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA，但不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，不能消化单链或双链DNA或RNA[10]。因此只有当互补靶DNA碱基存在时，RNase H2才能消化DNA-RNA杂交链，使DNA-RNA杂交链在RNA碱基的5′-侧发生裂解，留下具有3′-羟基的DNA寡核苷酸，该3′-羟基DNA寡核苷酸能够起到引物的作用，从而允许引物延伸[11]。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生rhPCR引物的裂解切割，故极大地提高了反应的准确性。事实上，RNase H2是唯一能够通过水解核糖核酸5′-端的磷酸二酯键来启动无突变去除核糖核苷酸过程的酶[12]。

RNase H2具有热稳定性和温度依赖性，在70、60、50、30 ℃条件下的活性分别为70%、64%、23%、＜1%，且在95 ℃ 90 min条件下仍能保持2/3的活性[2]，这表明RNase H2足以在所有PCR预期的使用温度范围内保持活性。因此，在带有封闭式引物的rhPCR体系中，RNaseH2能够与任何热稳定的DNA聚合酶进行常规的热启动反应，极大降低了非特异性扩增和引物二聚体的形成，显著提高了检测特异性。RNase H2可能对错配的核糖核苷酸有轻微的切割活性，在rhPCR反应过程中应避免过量使用，否则将会导致出现非特异性扩增条带。RNase H2虽然能够识别具有不匹配的碱基对的底物，但发生在RNA-DNA碱基对（“0”位置）或其附近（“-3”、“-2”、“-1”和“+1”位置）的错配会显著降低RNase H2的切割效率（将RNA所在的核苷酸位置标为“0”位置，往5′-端的核苷酸依次标为“-1”、“-2”、“-3”；往3′-端的核苷酸依次标为“+1”、“+2”、“+3”），特别是当错配发生在RNA-DNA碱基对时，这一特性将会最大限度地降低同源序列的错误扩增，提高检测特异性。

1.2 rhPCR引物的设计与合成

常规PCR引物普遍存在自我扩增现象，这会导致PCR检测结果出现假阳性，或者由于自我扩增消耗引物及体系成分导致检测结果出现假阴性。虽然可以通过引物筛选设计、优化反应条件、应用热启动酶[13]、酶制剂AmpliTaq Gold或采用降落PCR技术[14]来减少引物二聚体[15]的产生，但一定程度上增加了检测成本和操作的复杂性。

rhPCR引物是在高度保守的目标寡核苷酸序列区域内插入1段RNA碱基序列，形成DNARNA-DNA的碱基序列，并且该引物的3′-末端被化学基团封阻，导致引物无法延伸。目前rhPCR引物设计以商用软件设计为主，最常使用的是PrimerQuest设计工具（美国Integrated DNA Technologies公司）[16]。在常用的引物序列之后（3′-末端）按照“rDDDDx”的模式加上后续碱基与修饰，合成相应的阻断式可切割的rhPCR引物，其中“r”是与目标DNA序列匹配的RNA碱基，“D”是与目标序列匹配的DNA碱基，“x”是C3丙二醇间隔区或终止双脱氧胞嘧啶ddC；或者以“rDxxDM”的模式添加末端碱基，其中“r”是与目标DNA序列匹配的RNA碱基，“D”是与目标序列匹配的DNA碱基，“xx”是2个C3间隔区，“M”是1个与目标序列错配的DNA碱基。要使RNase H2实现最佳切割，DNA 双链5′-端到RNA残基至少需要8～10个碱基对，DNA双链3′-端到RNA碱基则需要4～5个碱基对[17]。在rhPCR中，为确保RNA残基的5′-端裂解产物是功能性引物，5′-裂解端必须始终存在10个以上的DNA碱基。值得注意的是，rhPCR引物中RNA键的非特异性水解不能导致引物活化，只有通过RNase H2的裂解，rhPCR引物才能有活性，进行引物的延伸。即使二价阳离子（如Mg2+）或高温条件可以促进含有RNA的寡核苷酸非特异性水解，但在PCR的热循环条件下，引物的非特异性水解可以忽略不计。假如样本受到严重污染，则反应混合物中可以加入抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂。一方面封闭式可切割rhPCR引物的使用，使得引物在未被RNase H2识别和切割前不具有活性，避免引物的自我扩增；另一方面rhPCR引物的切割仅在其与互补的靶序列紧密结合时发生，可提高反应的特异性。

1.3 DNA聚合酶

目前最常用于PCR的热稳定DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶是从水生嗜热杆菌中提取的耐热DNA聚合酶，是第1个应用于PCR的极端耐热的DNA聚合酶，相对分子质量为94 000，含832个氨基酸，全长2 496 bp，在92.0、95.0、97.5 ℃时的半衰期分别为130、40、5～6 min。Taq DNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′核酸外切酶活性，无3′→5′外切酶活性，缺乏对单核苷酸配对错误时的校正能力，在PCR过程中错配率达到10-4[18]，且扩增效率会随着扩增子大小增加到1 kb以上而降低[19]。Taq DNA聚合酶活性易被环境和血液样本抑制，但该酶的适用温度满足rhPCR反应温度的全过程，只需在反应起始添加1次酶即可，简化了操作流程，可避免在反复添加酶的过程中造成污染。

随后学者们又逐步发现了有校正功能的耐热DNA聚合酶，包括Vent、Deep、 Pfu、Tgo、KOD1、Tga[20]等DNA聚合酶，这些酶都具有5′→3′核酸外切酶（校对）活性，能够纠正聚合反应过程中的错误配对，显著降低PCR过程中的错配率[21]，具有极高的保真性。虽然目前缺乏这些酶在rhPCR中的应用研究，但不可否认其具有一定的研究价值。

1.4 逆转录酶

在某些情况下，RNase H2依赖性PCR可以与逆转录PCR结合起来，用于RNA的检测[22]。这时候反应中就需要使用逆转录酶，先将RNA模板转换为cDNA再进行DNA扩增反应。目前常用的热稳定逆转录酶是AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶[23]，AMV逆转录酶在高温环境下保真性高于MMLV逆转录酶[24]，更适合rhPCR。AMV逆转录酶分离自重组禽类成髓细胞瘤，是由2个不同的亚基（α和β亚基）组成的异源二聚体[25]，具有多种活性，包括RNA和DNA依赖的DNA聚合酶活性、DNA-RNA解旋活性、序列特异的Mn2+依赖性核酸内切酶活性[26]，因此可逆转录含有大量二级结构的RNA靶序列。

1.5 Mg2+

Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。在反应过程中，Mg2+与dNTP及模板结合，降低了酶的活化能，从而促进酶的催化作用。由于模板杂交体的解链和退火温度受二价阳离子的影响，所以Mg2+浓度对反应的成功与否起重要作用[27]。RNase H2也是Mg2+依赖性酶，只有在有Mg2+的环境中才能发挥裂解作用[28]，同时Mg2+可以克服杂交结合结构域与核酸之间的非特异性相互作用[7]，可获得最佳的RNase H活性。Mg2+浓度对rhPCR同样非常重要，较高的游离Mg2+浓度可以增加rhPCR扩增产物量，但也会增加非特异性扩增，降低反应特异性，Mg2+浓度过低则会影响扩增效率，甚至导致扩增失败。总的来说，Mg2+浓度应高于dNTP浓度，常用浓度为1.5 mmol/L，但RNase H2在Mg2+浓度低至1 mmol/L时仍保持较高的活性。因此，普通PCR体系中应用的Mg2+浓度都适用于rhPCR体系。在多数情况下，为了确定rhPCR体系中的最佳Mg2+浓度，可以用递增Mg2+浓度的方法进行预实验，选出rhPCR体系最合适的Mg2+浓度，确保rhPCR扩增效率。

2 rhPCR的优点

与常规PCR相比，rhPCR利用RNaseH2在rhPCR引物与目标位点结合后激活rhPCR引物的特性，消除引物二聚体的形成，减少非特异性扩增[5]，且能提高检测灵敏度，在低丰度DNA及RNA的研究上具有较大优势。采用非热启动的DNA聚合酶能够降低rhPCR成本，同时rhPCR没有改变PCR的工作原理，可在rhPCR的基础上建立RNase H依赖性的实时荧光定量聚合酶链反应（ribonuclease H-dependent quantitative realtime polymerase chain reaction，rh-qPCR）检测体系。rh-qPCR在同属物种亚型分析方面优势明显：一些同属物种核苷酸序列差异性非常小，难以设计特异性的常规荧光定量PCR方法，采用rh-qPCR方法就能够很好地解决这个问题。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[29]目前应用较广，不需要模板的热变性及重复温度循环，也不需要特殊的仪器，操作简单，灵敏度较高。近来也有学者探寻其用于SNP基因分型的可能性[30]。但是，LAMP的假阳性问题严重，且容易形成气溶胶污染[31]，或者出现非特异性扩增的情况[32]。rhPCR的高特异性能够有效地避免LAMP的假阳性，其极高的检测灵敏度使得在低浓度的模板DNA反应中也能有很好的表现，且rhPCR同样具有操作简便、耗时短的特点。因此，LAMP难以满足多重PCR的技术要求，而rhPCR有望成为多重靶标核酸检测的主要方法。BELTZ等[33]报道了1次rhPCR同时检测2个SNP。与DNA测序法[34]相比，rhPCR灵敏度较高，与其他核酸分子检测技术相比，rhPCR具有一定的优势。

3 rhPCR的应用

由于rhPCR的反应特异性、灵敏度、保真度均优于传统PCR，且同时能够满足多重PCR技术的要求，降低了检测成本，缩短了检测时间。因此，rhPCR的应用范围越来越广，包括SNP检测、环境核酸的定性定量分析、牛乳miRNA人体生物利用研究、细菌基因分型等，涉及不同领域。

3.1 医学领域

DOBOSY等[2]开发rhPCR的初衷是为了检测与肿瘤密切相关的Smad7基因的SNP，提高其特异性。研究表明rhPCR能够通过消除引物二聚体的形成提高反应特异性，同时在同源序列的错误扩增方面，rhPCR的特异性远高于使用未修饰引物的传统PCR，同时还显示出比标准等位基因特异性PCR更大的区分度。BELTZ等[33]基于rhPCR原理研发了rhAmp SNP基因分型法并用于人类SNP基因分型的研究，证明rhPCR技术在SNP检测上具有突出的优势，基于rhPCR的多重SNP基因分型或将成为可能。WANG等[35]的研究结果显示，rhPCR可在人血浆中检测出牛miRNA，表现出极高的检测特异性（可区分核苷酸序列相差仅1个核苷酸的内源性和外源性miRNA）。LABBÉ等[16]证实，使用rhPCR鉴定海德堡沙门氏菌的基因分型比传统的脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）和噬菌体分型具有更高的分辨率，其检测结果与全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）完全相关，可作为WGS的一种快速、低成本的替代方案。LI等[36]运用rhPCR对T细胞受体进行测序，用以确定单细胞中配对的α/β T细胞受体（T cell receptor，TCR）克隆型，相对于其他TCR的测序方法，rhPCR操作流程大大简化，缩短了时间，也提高了测序的成功率。随着rhPCR技术的不断成熟和改进，其临床应用将会越来越广泛，有望成为基因诊断和临床个体化用药分析的首选技术平台。

3.2 非医学领域

rhPCR在非医学领域上的应用也越来越多。CAHOON等[37]证实rhPCR技术适用于藻类的SNP检测。ZUZAK等[38]使用rhPCR区分加拿大阿尔伯塔省常见芦苇的本地亚种和入侵亚种，该方法与广泛使用的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法一样精确，但更省时、简便且成本低。MCALLISTER等[39]在原有基础上开发出依赖RNase H2的rh-qPCR方法：采用rhPCR结合SYBR Green的方法绘制出标准曲线，用于量化山松甲虫真菌共生菌；该方法显示出比常规PCR更高的特异性和灵敏度，表明rh-qPCR适用于复杂环境样本的检测。RODGERS等[40]将rhPCR技术用于水生环境DNA（environmental deoxyribonucleic acid，eDNA）的研究中，解决了某些情况下因密切相关的同属物种缺乏线粒体序列多态性而无法使用常规特异性荧光定量PCR的问题，并且rhPCR的高灵敏度使其在低浓度样本的检测中具有明显优势；另外，他们还解决了复杂环境样本对RNase H2的抑制问题。高特异性和高灵敏度的rhPCR在密切相关物种鉴别和低浓度样本上具有独特优势，未来必然会有更多领域运用该技术。

4 rhPCR技术的展望

rhPCR技术通过RNase H2可选择性裂解RNA-DNA杂合链的特性以及特殊设计的封闭式可切割rhPCR引物实现了目标DNA扩增的高特异性、高灵敏度、高重复性，成为一种操作简便、耗时短、效率高的核酸检测技术。目前，国外学者已将rhPCR应用于SNP检测、环境核酸定量分析、细菌等位基因分型等多个领域，并取得一定的成果，但国内尚缺乏对这项技术的研究与应用。此外，rhPCR在多重PCR方面展示出其应用优势，能够解决多重PCR引物二聚体及非特异性扩增等诸多问题。在等位基因检测中，rhPCR对于密切相关的同属物种具有很好的适应性，而且与RFLP具有相同的精确性，耗时更少，成本更低。当检测多个样本时，rhPCR的检测效率会非常突出。由此可见，rhPCR技术在病原体及微生物基因型的快速检测与鉴别、遗传疾病诊断以及基因缺失、突变和多态性分析等领域具有不可限量的发展前景。rhPCR的技术难点在于rhPCR引物的设计，如果能够研究出快速自动设计rhPCR引物的软件，简化操作，提高效率，将会有更多领域采用该技术，在很大程度上能够推动rhPCR的大范围应用与技术发展。